坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的制

#一、實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)生理學(xué)實驗基本的組織分離技術(shù)。學(xué)習(xí)和掌握制備蛙類坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的方法。學(xué)習(xí)和掌握測定閾刺激強度和最大刺激強度的方法和肌肉收縮活動記錄方法。了解刺激種類，刺激強度，刺激頻率與肌肉收縮之間的關(guān)系。觀察用不同頻率的最適刺激刺激坐骨神經(jīng)對腓腸肌收縮形式的影響及其特征，了解和掌握單收縮、復(fù)合收縮、強直收縮特征和形成的基本原理。二、實驗原理：蛙類的一些基本生命活動和生理功能與恒溫動物相似，若將蛙的神經(jīng)-肌肉標(biāo)本放在任氏液中，其興奮性在幾個小時內(nèi)可保持不變。若給神經(jīng)或肌肉一次適宜刺激，可在神經(jīng)和肌肉上產(chǎn)生一個動作電位，肉眼可看到肌肉收縮和舒張一次，表明神經(jīng)和肌肉產(chǎn)生了一次興奮。在生理學(xué)實驗中常利用蛙的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本研究神經(jīng)、肌肉的興奮、興奮性；刺激與反應(yīng)的規(guī)律和肌肉收縮的特征等，制備坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本是生理學(xué)實驗的一項基本操作技術(shù)。對于單根神經(jīng)纖維或肌纖維來說，對刺激的反應(yīng)具有“全或無”的特性。神經(jīng)-肌肉標(biāo)本是由許多興奮性不同的神經(jīng)纖維（細(xì)胞）-肌纖維（細(xì)胞）組成，在保持足夠的刺激時間（脈沖波寬）不變時，刺激強度過小，不能引起任何反應(yīng)；隨著刺激強度增加到某一定值，可引起少數(shù)興奮性較高的運動單位興奮，引起少數(shù)肌纖維收縮，表現(xiàn)出較小的張力變化。蛙的坐骨神經(jīng)肌肉標(biāo)本單收縮的總時程約為0.11s,其中潛伏期、縮短期共占0,05s,舒張期占0.06s。若給予標(biāo)本一連串的最適刺激，則因刺激頻率不同會得到一連串的單收縮、不完全強直收縮或完全強直收縮的復(fù)合收縮。三、實驗對象：蛙四、實驗藥品：任氏液五、實驗儀器與器械：肌槽、張力換能器CL0g）、計算機生物信號采集處理系統(tǒng)；普通剪刀、金冠剪、手術(shù)剪、眼科鑷（或尖頭無齒鑷）、金屬探針（解剖針）、玻璃分針、蛙板（或玻璃板）、細(xì)線、培養(yǎng)皿、滴管、雙凹夾、銅鋅弓。六、實驗方法與步驟：1．蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備.破壞腦、脊髓②.剪除軀干上部、皮膚及內(nèi)臟③.剝皮④．分離兩腿⑤．辨認(rèn)蛙后肢的主要肌肉⑥．游離坐骨神經(jīng)和腓腸?、撸羧ザ嘤嗟募怪图∪猗?完成坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本⑨.檢驗標(biāo)本2．觀測不同刺激強度對坐骨神經(jīng)-腓腸肌活動的影響標(biāo)本放置：將蛙肌板，張力換能器均用雙凹夾固定于支架上；標(biāo)本的股骨殘端插入蛙肌板固定小孔內(nèi)并固定；腓腸肌跟腱上的連線連于張力換能器的應(yīng)變片上,坐骨神經(jīng)輕搭在蛙肌板的刺激電極上。測定閾強度：單脈沖刺激方式，波寬調(diào)至并固定在1ms,刺激強度從零開始逐漸增大；首先找到能引起肌肉收縮的最小強度，該強度即是閾強度。描記速度要求每刺激一次神經(jīng)，都應(yīng)在記錄紙或屏幕上記錄（或顯示）一次收縮曲線（應(yīng)為一短線）。測定最大刺激強度：將刺激強度逐漸增大，觀察肌肉收縮幅度是否隨著增加，記下的收縮曲線幅度是否也隨之升高，繼續(xù)增大刺激強度，直至連續(xù)3?4個肌肉收縮曲線的幅度不再隨刺激增高為止，讀出剛剛引起最大收縮的刺激強度，即為最適刺激強度。3.觀察不同刺激頻率對肌肉收縮的影響標(biāo)本制備，儀器及標(biāo)本連接同上。測定標(biāo)本的最適刺激強度：以波寬為1ms,從最小刺激強度開始逐漸增加刺激強度對肌肉進(jìn)行刺激,找到剛剛引起肌肉最大收縮的刺激強度,即為該標(biāo)本的最適刺激強度,整個實驗過程中均固定在此刺激強度上（一般為5?7.5v）。記錄單收縮曲線：用單刺激作用于坐骨神經(jīng)，可記錄到肌肉的單收縮曲線。記錄復(fù)合收縮曲線：用雙刺激作用于坐骨神經(jīng)，使兩次刺激間隔時間為0.06?0.08s,記錄復(fù)合收縮曲線（紙速25?50mm/s）。記錄不完全強直收縮和完全強直收縮：將刺激方式置于''連續(xù)〃，其余參數(shù)固定不變，用頻率為1、6、10、15、20、30Hz的連續(xù)刺激作用于作用于坐骨神經(jīng)，可記錄到單收縮、不完全強直收縮和完全強直收縮曲線（紙速2?10mm/s）。七、實驗結(jié)果1、坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備腓腸肌股骨制備好標(biāo)本（如上圖），該標(biāo)本保留小段脊髓、股骨，坐骨神經(jīng)連接脊髓和腓腸肌。用沾有任氏液的鋅銅弓觸及一下坐骨神經(jīng)，腓腸肌發(fā)生迅速而明顯的收縮，說明標(biāo)本的興奮性良好。2、骨骼肌單收縮分析腓腸肌股骨制備好標(biāo)本（如上圖），該標(biāo)本保留小段脊髓、股骨，坐骨神經(jīng)連接脊髓和腓腸肌。用沾有任氏液的鋅銅弓觸及一下坐骨神經(jīng)，腓腸肌發(fā)生迅速而明顯的收縮，說明標(biāo)本的興奮性良好。2、骨骼肌單收縮分析給予青蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本一次閾上刺激（強度：450mv；波寬：5ms）,腓腸肌發(fā)生一次坐骨神經(jīng)單收縮，其潛伏期為16ms，收縮期為88ms,舒張期為350ms。（記錄結(jié)果見表1、圖1）表1：骨骼肌單收縮各期的結(jié)果：（單位：ms）骨骼肌單收縮潛伏期收縮期舒張期時程（ms）16883503、刺激強度對肌肉收縮的影響：朿U激青蛙的腓腸肌時，不同的刺激強度會引起肌肉的不同反應(yīng)。當(dāng)刺激強度在0.15V（不包括0.15V）時以下時，沒有引起肌肉收縮反應(yīng)；當(dāng)給予腓腸肌0.15V的刺激強度時，肌肉剛好能引起肌肉發(fā)生收縮反應(yīng)，肌肉的收縮力大約為0.12g；當(dāng)刺激強度在0.15〈V〈0.45時，隨著刺激強度的增加肌肉收縮的力量逐漸變大，收縮力在0.12-3.8g之間；當(dāng)刺激強度在0.45V以上時，即使再增加刺激強度，肌肉收縮的力量也不再隨之增大，肌肉收縮力維持在4.8g的水平上。綜合實驗結(jié)果，我們得知0.15V（不包括0.15V）以下的刺激是是閾下刺激，0.15V是閾刺激，0.45V是引起青蛙腓腸肌發(fā)生收縮反應(yīng)的最適刺激強度。實驗結(jié)果見表2和圖2。表2：青蛙腓腸肌刺激強度與骨骼肌收縮反應(yīng)的關(guān)系刺激強度(V)<0.150.150.15〈V〈0.450.45肌肉收縮力（g）00.120.12-3.84.8閾下刺激閾刺激閾上刺激最大刺激'張力：gUJU150125100?755025時間：ms圖2：青蛙腓腸肌刺激強度與骨骼肌收縮反應(yīng)的關(guān)系注：f1表示刺激強度為0.41v,f2表示刺激強度為0.42v,f3表示刺激強度為0.43v,f4表示刺激強度為0.44v……..刺激強度依次增加0.01V4、刺激頻率對肌肉收縮的影響改變刺激頻率，青蛙的腓腸肌的收縮情況發(fā)生變化。刺激頻率為1Hz時，肌肉只發(fā)生單收縮；當(dāng)刺激頻率2-15Hz時，出現(xiàn)多個收縮的疊加，為不完全強直收縮；當(dāng)刺激頻率大于16Hz時，肌肉收縮完全融合，為完全強直收縮。實驗結(jié)果見表3和圖3。表3：刺激頻率和肌肉收縮的關(guān)系刺激頻率（Hz）12-1516肌肉收縮力（g）1.13.3-12.112.3收縮類型單收縮不完全強直收縮完全強直收縮張力g完全直收縮200不完全強直收縮■wo■0■■wo肌肉收縮力（g）1.13.3-12.112.3收縮類型單收縮不完全強直收縮完全強直收縮張力g完全直收縮200不完全強直收縮■wo■0■■wof2Hzff4Hif5Hz1f?Hif0Hi恤f1OK:fIIHef12Hzf13K;114Ki115Kzf悅f17Ht圖3：青蛙腓腸肌刺激頻率和肌肉收縮的關(guān)系（縱坐標(biāo)每一刻度實際上等于0.076g）juu時間：ms?AAA5■將5g的砝碼掛于張力換能器應(yīng)變片上得到下圖六、分析與討論實驗過程中需要注意是：1）坐骨神經(jīng)標(biāo)本的制備過程中神經(jīng)干應(yīng)盡可能分離得長（上起脊椎處的主干,下沿腓總神經(jīng)與脛神經(jīng)一直分離至踝關(guān)節(jié)附近）,腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)均應(yīng)保留;2）在制備坐骨神經(jīng)標(biāo)本過程中應(yīng)盡量少損傷神經(jīng),以確保神經(jīng)標(biāo)本的興奮性。3）在連接生理采集系統(tǒng)的時候，需要注意將股骨部分的結(jié)締組織剔除干凈，否則難以固定在固定孔內(nèi)影響實驗結(jié)果。注意調(diào)節(jié)扎線的松緊，是肌肉自然拉平，保證肌肉一旦收縮，即可牽動張力傳感器的應(yīng)變梁，使記錄的結(jié)果跟加精準(zhǔn)。每兩次刺激之間要讓肌肉休息半分鐘，避免反復(fù)地刺激引起神經(jīng)干疲勞,導(dǎo)致神經(jīng)干的興奮性降低。刺激過程當(dāng)中，需要不斷用任氏液濕潤標(biāo)本，以保持良好的興奮性。實驗時活性降低的原因:在制備標(biāo)本時由于粗心，坐骨神經(jīng)受損。制備時間過長，并且沒有經(jīng)常地進(jìn)行任氏液濕潤。刺激過于頻繁，肌肉疲勞，且過度的經(jīng)常性刺激會使標(biāo)本的活性下降，影響實驗結(jié)果。刺激強度與肌肉收縮的關(guān)系神經(jīng)細(xì)胞的興奮是由于膜內(nèi)外的鈉離子與鉀離子的濃度變化引起的，膜上存在著許多鈉離子與鉀離子通道，這些通道由電壓門控系統(tǒng)控制。因此閾下刺激不足以引起該通道的開放，導(dǎo)致無興奮的產(chǎn)生，而閾刺激