液體菌種在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)效果的研究

液體菌種在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)效果的研究

液體藥品的生產(chǎn)過程簡單，生產(chǎn)周期長，菌漿質(zhì)量高，接種方便，易于加工和生產(chǎn)，已成為發(fā)展趨勢。2005年8～9月,我們引進(jìn)浙江大學(xué)液體菌種生產(chǎn)線(5組200L液體發(fā)酵罐)進(jìn)行液體菌種生產(chǎn)試驗(yàn)和試生產(chǎn),取得了較好的效果。但液體菌種在制種中,由于地區(qū)條件差異,引進(jìn)技術(shù)還需要加以改進(jìn),生產(chǎn)中出現(xiàn)的一些問題也需要加以注意,在此重點(diǎn)對(duì)污染預(yù)防和質(zhì)量檢查問題進(jìn)行探討。1液體菌的特征液體菌種與固體菌種相比有以下優(yōu)點(diǎn):1.1疫苗生產(chǎn)過程簡單同一種培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的液體菌種,可作為母種使用,也可作為原種、栽培種使用,減少了培養(yǎng)基的更換和培養(yǎng)環(huán)境的改變。1.2液體菌種培養(yǎng)周期固體菌種從母種到栽培種三級(jí)制種的時(shí)間為2個(gè)月,而液體菌種只需20天;培養(yǎng)固體原種或栽培種的時(shí)間需25～40天,而培養(yǎng)一批液體菌種只需3～7天。液體菌種大大地縮短了制種時(shí)間。1.3菌的世代相同液體菌生長旺盛,生活力強(qiáng),定植快。接種后,萌發(fā)點(diǎn)多,發(fā)菌快,出菇周期短。1.4機(jī)械化生產(chǎn)線液體菌種可以用注射等多種形式接種,接種方法簡便、快速、均勻,適合于機(jī)械化、自動(dòng)化大規(guī)模生產(chǎn)使用。用液體菌種接種一般每袋成本1～3分,每人每小時(shí)可接800袋以上,提高效益4～5倍。1.5降低雜菌污染率液體菌種定量、均勻噴接于料面,菌種萌發(fā)封面好,降低了雜菌污染率。同時(shí),菌瓶、菌袋之間菌齡均勻一致,發(fā)滿瓶、袋快,出菇整齊產(chǎn)品質(zhì)量好1.6培養(yǎng)基的選擇以豆粕、米糠、蔗糖、馬鈴薯、玉米粉、麥麩、花生餅粉等原料作為液體菌種培養(yǎng)基,價(jià)格低廉。同時(shí),液體菌種培養(yǎng)周期為1周左右,適宜于食用菌規(guī)?；?、周年化、工廠化生產(chǎn)。2種內(nèi)菌株球的重量衡量液體菌種生產(chǎn)效果的重要指標(biāo)就是生物量,它是指每100mL液體菌種中所含的菌絲體(球)的重量(g)。要取得良好的效果,除了采用合適的培養(yǎng)基之外,還需要適宜的培養(yǎng)條件,包括:溫度、壓力、溶解氧、通氣量、pH值、糖、氮、菌絲形態(tài)、菌絲含量、接種量、培養(yǎng)時(shí)間等參數(shù)。2.1不同的菌體及同一菌體在不同代謝期間的生長和產(chǎn)量分布它可影響發(fā)酵過程中基質(zhì)的反應(yīng)速率及氧的溶解度。不同的菌體及同一菌體在不同的代謝階段其適應(yīng)的溫度不同,但以22℃～26℃最為適宜,在此溫度范圍內(nèi),菌絲體生長最快,產(chǎn)量最高。2.2增加溶解氧和污染增加干酵母粉的污染發(fā)酵罐內(nèi)維持一定的壓力可控制壓力為零時(shí)的雜菌污染,并且可增加發(fā)酵液中的溶解氧?？紤]到二氧化碳在水中的溶解度比氧大很多,因此罐壓不宜過度,一般可控制在0.3～0.5Mpa。2.3食用菌的液體制備工藝發(fā)酵過程中的溶解氧與很多因素有關(guān),包括通風(fēng)量、攪拌程度、培養(yǎng)基粘度、壓力等。食用菌的液體制種過程中,氧的消耗與菌體的不同生長階段有關(guān),一般在對(duì)數(shù)生長期為最大。提高通風(fēng)量,增加攪拌程度,可提高溶解氧量,菌絲體的得率也有一定的提高。2.4培養(yǎng)液中的氧通氣對(duì)液體培養(yǎng)極為重要,因?yàn)樵谝后w培養(yǎng)過程中,菌絲體呼吸所需要的氧是來自培養(yǎng)液中的溶解氧,因此,必須不斷地向培養(yǎng)液中提供溶解的無菌空氣,并及時(shí)趕走代謝產(chǎn)生的廢氣,否則將導(dǎo)致培養(yǎng)液中的菌絲細(xì)胞很快死亡。2.5不受雜菌感染的種發(fā)酵液的pH是整個(gè)發(fā)酵過程中各種生化反應(yīng)的綜合指標(biāo),也是保證液體菌種不受雜菌感染的重要指標(biāo)。通過對(duì)pH的監(jiān)控,可以了解菌體的生長規(guī)律及代謝特征,掌握菌體的生長情況,培養(yǎng)出合格的液體菌種。2.6sundowner公司發(fā)酵液中的糖包括總糖和還原糖,還原糖的變化反映了菌體對(duì)碳源的利用情況,殘?zhí)堑亩嗌贈(zèng)Q定菌體培養(yǎng)的好壞。2.7氮傳感器發(fā)酵液中氨態(tài)氮的變化顯示出發(fā)酵液中氮源的變化規(guī)律,可取樣液采用化學(xué)方法測定。2.8形式1通過對(duì)發(fā)酵液的鏡檢,觀察菌絲形態(tài)的變化,從中了解菌絲的生長情況。2.9蘑菇含量可通過菌絲含量的測定,了解菌絲生長情況以及與各種參數(shù)之間的關(guān)系,為確定最佳生長條件及生產(chǎn)工藝提供科學(xué)的依據(jù)。2.10共享性容量接種量直接影響到菌絲的生長速度、生長質(zhì)量。2.11培訓(xùn)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間越長,菌絲體越多,但是所需要的養(yǎng)分也越多,感染雜菌的機(jī)會(huì)也越多。3接種后菌袋污染原因用液體菌種生產(chǎn)栽培種,同固體菌種相比,除降低成本、縮短周期、提高產(chǎn)量外,而且降低污染率4%左右(固體菌種污染率在5%左右,而液體菌種污染率不足1%),但如不注意相關(guān)環(huán)節(jié),也會(huì)造成接種后菌袋污染,主要原因有以下幾個(gè)方面:3.1培養(yǎng)基的完全消毒在菌袋滅菌過程中因溫度或時(shí)間處理不當(dāng),造成滅菌不夠徹底,液體菌種接入后,菌絲長至1/3左右時(shí),雜菌由料中間向外生長造成污染。3.2接種環(huán)境不合格接種環(huán)境過于粗放、接種室處理程度不夠等原因?qū)е陆臃N環(huán)境相對(duì)較差,接種過程中雜菌及其它孢子落入菌袋、菌筐的外表面而導(dǎo)致染菌。3.3反應(yīng)時(shí)間的染菌性使用液體菌種初期,扎袋(口)、封袋(口)技術(shù)不熟練,使培養(yǎng)基在空氣中暴露時(shí)間過長,或接種槍頻頻接觸菌袋、菌筐的外表面而導(dǎo)致染菌。3.4培養(yǎng)基蛋白濃度:對(duì)于原有培養(yǎng)營養(yǎng)液體菌種正常培養(yǎng)條件下,當(dāng)達(dá)到培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)殘?zhí)菨舛纫话阍?.5%以下,若配置培養(yǎng)基時(shí)糖濃度太大,或其它原因?qū)е職堄酄I養(yǎng)物質(zhì)濃度過高,雜菌極易在這樣的營養(yǎng)液體上萌發(fā)、繁殖,因而易導(dǎo)致染菌。3.5細(xì)菌的繁殖液體菌種老化甚至自溶以后再接種萌發(fā)能力大大降低或不萌發(fā),而局部濕度又大,因而易造成染菌。3.6連接時(shí)間培養(yǎng)好的液體菌種應(yīng)該馬上用于生產(chǎn),這樣菌種活力強(qiáng),萌發(fā)好。液體菌種保藏后使用,易造成菌種酶活性下降或菌體自溶,降低活力。3.7勻覆蓋表面的接種液體菌種接種量以菌種接入瓶或袋內(nèi)均勻覆蓋表面為宜。通常850mL的塑料瓶接種15～18mL。接種量少,菌種局部萌發(fā)、封面,易造成污染。3.8培養(yǎng)料殺菌不徹底試驗(yàn)表明,液體菌種較固體菌種對(duì)培養(yǎng)料質(zhì)量要求高。培養(yǎng)料殺菌不徹底、發(fā)酸變質(zhì)、含水量不適宜等,均會(huì)導(dǎo)致液體菌種萌發(fā)效果不好。在生產(chǎn)上,往往將液體菌種萌發(fā)效果不好歸結(jié)于菌種質(zhì)量而忽視了料的質(zhì)量。4液體藥品的質(zhì)量分析培養(yǎng)結(jié)束時(shí),液體菌種必須經(jīng)過質(zhì)量檢查才能使用。4.1由細(xì)菌中自然乳狀液染色(1)純度檢查鏡檢或平板培養(yǎng)無細(xì)菌、霉菌析出。(2)活力檢查鏡檢菌球邊緣菌絲分支細(xì)密,用結(jié)晶液染色時(shí)著色深,菌絲細(xì)胞原生質(zhì)尚未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象和空胞,靜止5min,醪泥不下沉。(3)菌球大小80%菌球直徑小于lmm。(4)出菇能力香菇、平菇等菌絲鏡檢有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu),醪泥靜止培養(yǎng)有原基形成。4.2菌種的取樣在液體菌種生產(chǎn)過程中,我們總結(jié)出一套簡便、直觀的檢測方法:(1)菌液顏色如培養(yǎng)液顏色混濁,大多為細(xì)菌、放線菌、酵母菌污染,不能作為菌種使用。菌液中加入糖等營養(yǎng)物質(zhì),滅菌后溶液成淺茶紅色,隨著營養(yǎng)的被利用,溶液顏色也越來越淡,絕大多數(shù)呈淡黃色或橙黃色,如平菇、金針菇。也有些品種比較特殊,如香菇、猴頭的培養(yǎng)液呈黃棕色。黑木耳的培養(yǎng)液呈青褐色,粘稠,有香甜味。密環(huán)菌呈淺棕色。(2)菌液氣味菌種培養(yǎng)前期,因菌液中含有大量單、多糖類營養(yǎng)物質(zhì),因而糖香味很濃,隨著營養(yǎng)的被利用,菌液的糖香味越來越淡,取而代之的是菌絲特有的芳香氣味。而染菌的培養(yǎng)液則散發(fā)出酸、甜、霉臭、酒精等各種異味。(3)菌絲