小柴胡顆粒中5種主要指標(biāo)性成分的含量測定

小柴胡顆粒中5種主要指標(biāo)性成分的含量測定

小柴胡湯是小柴胡湯的原始制備。它是治療少陽病的主要方劑。它由柴胡、黃甘草、黨參、半夏、生姜和棗組成?，F(xiàn)代藥理研究表明,小柴胡湯具有廣泛的藥效,該方有較好的解熱作用,能抑制發(fā)熱動(dòng)物體溫的升高,體外可抑制多種細(xì)菌生長,對(duì)肝臟、胰臟、肺臟和胃腸功能有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用,在臨床上有廣泛的應(yīng)用。目前對(duì)小柴胡顆粒的質(zhì)量控制多采用薄層鑒別法、高效液相色譜法、薄層掃描法等對(duì)黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷等成分進(jìn)行定量分析,這些方法測定成分單一,難以全面評(píng)價(jià)小柴胡顆粒的質(zhì)量。而用于中藥質(zhì)量控制的色譜特征譜,比目前沿用的方法所提供的信息更加豐富,它通過抽提復(fù)方中具有藥材歸屬的特征信息,利用其中特征數(shù)據(jù)的比較,可以準(zhǔn)確靈敏地反映出復(fù)方的質(zhì)量特性,在對(duì)復(fù)方質(zhì)量評(píng)價(jià)的全面性以及復(fù)方藥材組合關(guān)系的分析上有著良好的識(shí)別和鑒別功能,可為大復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供一種有效的途徑。應(yīng)用色譜特征譜控制中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量,是中藥復(fù)方制劑走向國際的前提條件。因此本研究在建立了HPLC同時(shí)測定小柴胡顆粒中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素和甘草次酸5種有效成分含量方法的同時(shí),還對(duì)10批小柴胡顆粒進(jìn)行了色譜特征譜的分析與探討,為小柴胡顆粒的內(nèi)在質(zhì)量控制提供了一種較為全面的分析手段。小柴胡顆粒的提取Agilent1100型高效液相色譜儀,包括在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器(美國Agilent公司)。黃芩苷(baicalin,批號(hào):101009)、黃芩素(baicalein,批號(hào):101107)、漢黃芩苷(wogonoside,批號(hào):110325)、漢黃芩素(wogonin,批號(hào):101229)和甘草次酸(enoxolone,批號(hào):101231)對(duì)照品均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司,純度均>98.0%,10批小柴胡顆粒均購自南京各大藥房(表1)。精密稱取黃芩苷15.54mg、黃芩素10.00mg、漢黃芩苷8.24mg、漢黃芩素8.90mg和甘草次酸8.10mg,置于10mL量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度分別為1.55、1.00、0.82、0.89和0.81mg·mL-1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。臨用前,用甲醇將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得6個(gè)濃度水平的混合對(duì)照品工作溶液,供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用。取小柴胡顆粒適量,研細(xì),精密稱取約1.50g,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇50mL,密塞,稱定重量,超聲提取30min,放冷,再稱定,用70%乙醇補(bǔ)足失重,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。色譜柱:AgilentKromasilC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),保護(hù)柱:C18(50mm×4.6mm);流動(dòng)相:A相為0.1%磷酸水溶液,B相為乙腈,線性梯度洗脫程序:0~10min,0~10%B;10~15min,10%~20%B;15~25min,20%~40%B;25~35min,40%~42%B,35~45min,42%~100%B;45~50min,100%B;流速:1.0mL·min-1;檢測波長:254nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL。結(jié)果1小柴胡的含量是測量的1.1線性范圍及檢出限各混合對(duì)照品工作溶液分別在6個(gè)濃度點(diǎn)平行測定3次。以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量X(mg)對(duì)色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)于待定量的5種物質(zhì),在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,峰面積值與供試品質(zhì)量呈線性關(guān)系,回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限結(jié)果見表2。結(jié)果表明各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。1.2方法的回收率測定試驗(yàn)分別精確吸取含量分析用混合對(duì)照品工作溶液10μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,以峰面積值為指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6),考察方法的精密度。按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法平行制備6份供試液,在含量分析色譜條件下,測定5種成分含量,以峰面積值為指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6),考察方法的重復(fù)性。取上述供試液,分別間隔0、1、2、4、8、12和24h進(jìn)樣分析,測定5種成分含量,以峰面積值為指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6),考察供試品的穩(wěn)定性。在已知各成分含量的待提取供試品中分別定量加入5種成分的混合對(duì)照儲(chǔ)備液,考察方法的平均回收率(n=6)。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率結(jié)果見表3。1.3不同制造商的小柴胡顆粒含量分析分別測定10個(gè)不同廠家生產(chǎn)的小柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和甘草次酸的含量,結(jié)果見表4。2小柴胡顆粒特征家譜2.1小柴胡顆粒相似度評(píng)價(jià)以出峰時(shí)間居中、峰面積較大的黃芩苷作為參照峰,采用國家藥典委員會(huì)相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004Af)軟件對(duì)10批小柴胡顆粒進(jìn)行相似度評(píng)價(jià),共標(biāo)定了12個(gè)共有峰作為特征峰,圖1為10批樣品特征譜(a)和共有模式圖譜(b)。10批樣品圖譜的相似度分別為0.976、0.971、0.982、0.908、0.973、0.981、0.923、0.959、0.958和0.966。2.2穩(wěn)定性測定法制備6份平行樣品,在特征圖譜色譜條件下,考察方法的重復(fù)性;取其中一份樣品連續(xù)進(jìn)樣6次,考察方法的精密度;間隔0、1、2、4、8、12和24h分析同一樣品,考察樣品的穩(wěn)定性。以3號(hào)峰黃芩苷為參照峰,分別計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積和RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性方法學(xué)考察中分別有10個(gè)、10個(gè)和9個(gè)峰相對(duì)峰面積RSD小于3.0%,12個(gè)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于3.0%,符合特征圖譜的要求。小柴胡顆粒成分組成小柴胡顆粒中君藥是柴胡,臣藥是黃芩,佐藥是甘草。黃芩主要含黃酮類化合物,具有抗菌、抗病毒、抗炎和解熱作用,其中黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷和漢黃芩素是主要的有效成分。還有研究認(rèn)為甘草次酸有很好的抗炎作用。因此可以選擇黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素和甘草次酸作為小柴胡顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究對(duì)小柴胡顆粒中主要指標(biāo)性成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和甘草次酸進(jìn)行了含量分析,同時(shí)建立了小柴胡顆粒的特征圖譜。研究表明,小柴胡顆粒相應(yīng)的共有峰均已在色譜圖上有所體現(xiàn),雖然各峰面積略有不同,這說明小柴胡顆粒中的各地藥材的組成成分在含量上有一定差異,但相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表