高效液相色譜-質(zhì)譜lc-msms檢測水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物3甲-基-喹惡啉-2羧-酸的殘留

高效液相色譜-質(zhì)譜lc-msms檢測水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物3甲-基-喹惡啉-2羧-酸的殘留

托吡魯西翁（olaquino）也被稱為異羥色胺。這是一種合成的過敏劑。通常用于動物生產(chǎn)，以提高飼料的轉(zhuǎn)化率。其在動物體內(nèi)吸收迅速,生物利用度高,原藥排除速度快,但代謝產(chǎn)物3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)在組織內(nèi)殘留時間比較長,被人食用后具有潛在的危害性。農(nóng)業(yè)部規(guī)定了喹乙醇在豬肉和肝臟的最高殘留限量,標(biāo)志殘留物即為MQCA,但其它畜禽類及水產(chǎn)品暫時沒有明確的規(guī)定。研究MQCA的檢測方法,可以有效地監(jiān)控喹乙醇在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用,對保障食品安全具有重要意義。當(dāng)前檢測喹乙醇的方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等,但直接檢測喹乙醇標(biāo)志殘留物MQCA的方法比較少,難以對喹乙醇在動物生產(chǎn)方面的使用做到比較全面的監(jiān)控。該研究在參考前人研究工作的基礎(chǔ)上,主要改進(jìn)和優(yōu)化了前處理方法,建立了水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物的HPLC-MS/MS檢測方法。1實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑與材料3-甲基-喹惡啉-2-羧酸和喹惡啉-2-羧酸-d4(QCA-d4)標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司);Protease蛋白酶及Tris堿均購自美國Sigma公司;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯等均為色譜純或分析純;水為超純水;羅非魚、對蝦等從農(nóng)貿(mào)市場或超市購買。分別用甲醇溶解MQCA和QCA-d4的對照品制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,儲存于-20℃冰箱中。使用時配成不成濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。1.2儀器與設(shè)備液質(zhì)聯(lián)用儀由Agilent1200液相系統(tǒng)(配備自動進(jìn)樣器)和API3000三重四極桿質(zhì)譜串聯(lián)組成,氮?dú)獯蹈蓛x、離心機(jī)、MilliQ器(美國Millipore公司)等。1.3色譜-質(zhì)譜條件1.3.1色譜條件WatersC18色譜柱(100mm×2.1mm,5μm)。流動相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液(體積比為20∶10∶70),等度洗脫;流速:0.25mL/min。柱溫:30℃。進(jìn)樣量:10μL。1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI),正離子檢測模式,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),電噴霧電壓(IS)為4500V,霧化氣壓力(NEB)為34kPa,氣簾氣壓力(CUR)為55kPa,離子源溫度(TEM)為500℃,碰撞室壓力(CAD)為48kPa。1.4樣品處理1.4.1酶解將水產(chǎn)品的可食部分用絞肉機(jī)絞成肉泥狀,準(zhǔn)確稱取2g(±0.02g)于50mL聚丙烯離心管中,加入質(zhì)量濃度為0.1μg/mL的QCA-d4內(nèi)標(biāo)溶液100μL,靜置30min。加入0.6%的甲酸溶液5mL,旋渦30s后置于47℃水浴中振搖1h,取出依次加入1.5mL濃度為1mol/L的Tris緩沖溶液和0.15mL質(zhì)量濃度為0.01g/mL的Protease蛋白酶水溶液,充分混合均勻后再在47℃水浴中振搖16h。1.4.2提取加入10mL0.3mol/LHCl溶液,振蕩5min以滅活蛋白酶。然后加入5mL乙酸乙酯,旋渦振蕩1min,以4200r/min的速度離心10min,吸取上清液于10mL玻璃管,再加入5mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次,合并上清液于45℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入1mL流動相溶解殘?jiān)?過0.22μm的濾膜后上機(jī)檢測。1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密量取20、40、100、200、400、2000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL,置于不同的離心管中,每只離心管中都加入質(zhì)量濃度為100μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液100μL,按1.4所述方法處理,內(nèi)標(biāo)法定量,制作1、2、5、10、20、100μg/kg添加水平標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.6回收率與定量限按照上述方法,分別制得2、4、8μg/kg添加水平樣品,每個添加水平做6個平行,測定本方法的回收率。按前述方法處理,制得0.1、0.2、0.5、1、2μg/kg添加水平樣品,供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定,以最低檢出濃度計(jì)算,10倍信噪比定為定量限。2結(jié)果與討論2.1前處理方法的確定殘留于水產(chǎn)品中的喹乙醇使用乙腈即可有效提取,但其代謝產(chǎn)物MQCA在體內(nèi)與蛋白質(zhì)以結(jié)合狀態(tài)存在,直接用乙腈提取效率很低。該研究的前處理借鑒Joe處理豬肉等組織樣品的方法,先用0.6%的甲酸溶液滅活組織中自然存在的酶,然后加入protease蛋白酶分解蛋白質(zhì),以游離出目標(biāo)物MQCA。protease蛋白酶在47℃的堿性條件下活性最強(qiáng),加入Tris緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值,16~18h即可酶解完成。再用0.3mol/L的HCl滅活蛋白酶,以完成后續(xù)流程操作。與Joe不同的是,省略了固相萃取步驟,直接用乙酸乙酯萃取出目標(biāo)物后濃縮,殘?jiān)儆昧鲃酉嗳芙夂蠹纯缮蠙C(jī)檢測。在檢測鰻鱺等脂肪含量比較高的水產(chǎn)品時,濃縮之后需用正己烷或石油醚脫脂。Joe的固相萃取法比較繁瑣,完成整個操作流程需時較長,還要耗費(fèi)大量的有機(jī)溶液,將其應(yīng)用于水產(chǎn)品的檢測時,回收率都在20%以下,難以進(jìn)行準(zhǔn)確地定性和定量分析,不利于實(shí)際應(yīng)用時水產(chǎn)品中MQCA殘留的批量檢測。2.2液相色譜分析條件的確定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀不宜使用非揮發(fā)性鹽類作為流動相,故其選擇范圍就比較狹窄。在檢測MQCA時,單獨(dú)的甲醇或者乙腈與0.1%的甲酸溶液組成流動相,信噪比低、峰形較差。采用甲醇、乙腈和0.1%甲酸溶液以2∶1∶7的比例組成流動相,響應(yīng)值比較高,且能有效改善峰形拖尾現(xiàn)象。不同規(guī)格的色譜柱,進(jìn)樣量的多少對分析結(jié)果的影響比較大。該研究采用100mm×2.1mm,5μm的柱子,在2~10μL的范圍內(nèi),進(jìn)樣量與響應(yīng)值成正相關(guān),且峰形良好。典型總離子流圖如圖1所示。2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化將質(zhì)量濃度為1μg/mL的MQCA和QCA-d4標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以5μL/min的速度用針泵連續(xù)進(jìn)樣做一級質(zhì)譜全掃描,均可得到[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰。以其作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,選取信號相對較強(qiáng)的兩個特征碎片離子,與其母離子組成多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)離子對,以QCA-d4作為內(nèi)標(biāo)物,即可對MQCA進(jìn)行定性和定量分析。QCA-d4只需選取一個特征離子與母離子組成離子對即可。具體檢測條件見表1。2.4線性范圍、回收率與定量限在1~100μg/kg的范圍內(nèi),按照上述條件分析,以MQCA的峰面積(y)為縱坐標(biāo)、濃度(x,μg/kg)為橫坐標(biāo),計(jì)算得到的線性回歸方程為y=4.61x-0.174,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999。參照農(nóng)業(yè)部規(guī)定的喹乙醇在豬肉中的最高殘留限量4μg/kg,該研究在空白羅非魚樣品基質(zhì)中添加2、4、8μg/kg的MQCA。在此三個水平上,回收率在82.5%~87.5%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD