第三章基因工程載體

第三章基因工程載體第1頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月基因克隆載體要讓一個從甲生物細胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體內(nèi)進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內(nèi)去。能將外源基因送入細胞的工具就是運載體。基因克隆載體(DNA克隆載體)：通過不同途徑能將承載的外源DNA片段(基因)帶入受體細胞，并在其中得以維持的DNA分子。第2頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能及特征一、發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。

第3頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件第4頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月載體應(yīng)具備的條件在克隆載體DNA分子合適的位置有一至多個克隆位點，供外源DNA片段組入克隆載體DNA分子。至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。至少應(yīng)有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞?？寺≥d體必須是安全的。第5頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

質(zhì)?？寺≥d體第7頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)：細菌，偶見于鏈霉菌和酵母獨立于染色體之外進行復(fù)制和遺傳,又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。比病毒還簡單的亞細胞結(jié)構(gòu)，一旦離開寄主細胞則無法繁殖。第8頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性質(zhì)粒是細菌染色體外能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈的DNA分子在宿主細胞內(nèi)，質(zhì)粒一般以超螺旋共價閉合環(huán)DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。在體外理化因子作用下，質(zhì)?？梢猿蔀殚_環(huán)DNA分子（oc-DNA）或線形DNA分子（l-DNA）。在變性條件下，質(zhì)?？沙蔀閱捂淒NA分子（ss-DNA）。質(zhì)粒DNA分子大小1-100Kb以上。第9頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA的復(fù)制質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進行自主復(fù)制復(fù)制方向性：純單向性（ColEI）；純雙向性（F質(zhì)粒）；既有單向又有雙向性（R6K）。根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型：嚴緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1–數(shù)個拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10個拷貝以上stringentplasmid第10頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動控制控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合ori

E.coliColE1

plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’第11頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的自主復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制機制–質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動控制

控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep第12頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的不親和性有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖構(gòu)成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容第14頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒遷移革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由bom和mob基因決定第16頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月攜帶特殊的遺傳標記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質(zhì)合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第17頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒載體第18頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第19頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月二、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略1、能在轉(zhuǎn)化的受體細胞中進行有效的復(fù)制，并有較多的拷貝。2、含有盡可能多的克隆位點。3、含有供選擇克隆子的標記基因。4、構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體DNA分子盡可能小。5、根據(jù)特殊需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種“元件”（小DNA片斷），構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。第20頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月三、質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的設(shè)計和構(gòu)建過程的原則選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒（親本質(zhì)粒）。正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件。組裝合適的選擇標記基因。選用合適的啟動子。在能達到預(yù)期目的的前提下，構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建過程力求簡單。第21頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌質(zhì)粒克隆載體pBR322及其衍生質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建pBR322的構(gòu)建是質(zhì)粒載體構(gòu)建的一個典范。pBR322的親本質(zhì)粒pSF2124，含有Amp抗性基因pMB1，含有松弛型ColE1的復(fù)制起點（ori）Psc101，含有Tet抗性基因第22頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌質(zhì)粒克隆載體pBR322及其衍生質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建1、在菌體內(nèi)將R1drd19質(zhì)粒（沙門氏菌中R1質(zhì)粒的一種變異體）的易位子Tn3（攜帶有Amp抗性基因）易位到pMB1質(zhì)粒上，構(gòu)成一個較大的質(zhì)粒pMB3(13.3Kb)。pMB3AATT黏性末端環(huán)化導(dǎo)入大腸桿菌pMB8(2.6Kb)EcoRI*第23頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月2、從質(zhì)粒pSC101獲得四環(huán)素抗性基因（Tetr)。獲得pMB9（5.3Kb)第24頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月3、向pMB9引入Amp抗性基因。pSF2124的Tn3體內(nèi)易位至pMB9獲得pBR312(10.2Kb,具有Amp抗性基因和Tet抗性基因）pBR312pBR313(8.8Kb，除去Amp抗性基因中的BamHI位點）EcoRI*第25頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月4、pBR313pBR322(4.3Kb)pBR320(2.8Kb)pBR318（6.3Kb)去除兩個PstIEcoRII片斷去掉酶切酶切體外重組第26頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月四、常用質(zhì)粒載體類型1、克隆質(zhì)粒載體2、表達質(zhì)粒載體3、多功能質(zhì)粒載體4、穿梭質(zhì)粒載體第28頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月1、克隆質(zhì)粒載體克隆質(zhì)粒載體是指專用于基因或DNA片斷無性繁殖的質(zhì)粒載體。pBR322質(zhì)粒pUC系列的質(zhì)粒載體第29頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322質(zhì)粒具有較小的分子量，大小4363bp可以克隆大到6Kb的外源DNA片斷具有兩種選擇標記，即Ampr和Tetr。具有多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點Amp抗性基因內(nèi)可被PstI,PvuI,SacI切開，Tet抗性基因可被BamHI,HindIII切開，通過插入失活篩選重組子。在宿主細胞內(nèi)具有較高的拷貝數(shù)。一般一個細胞內(nèi)可達到15個，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在條件下，可達到1000-3000拷貝，如氯霉素。第30頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月CAPproteinbindingsite-591-554(compl.strand);mRNA(LacZ)startsatntposition507(compl.strand);lacrepressorbindingsite-507-487(compl.strand).第31頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322插入失活效應(yīng)第32頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月篩選重組子的示意圖第33頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月

BamHI片段(Tcr)

pBR322PstI(Apr)片段

重組分子I

重組分子Ⅱ(ApsTcr)(AprTcs）

PstI片段

外源DNABamHI片段利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程重組分子I

涂布Ap平板Apr轉(zhuǎn)化子

分別轉(zhuǎn)化E.coli(ApSTcS)重組分子Ⅱ涂布Tc平板Tcr轉(zhuǎn)化子影印到Tc平板上AprTcS為重組子AprTcr為原載體

影印到Ap平板上ApSTcr為重組子即為非重組子第34頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC系列的質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原來限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ‘基因

位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位點(MCS，multiplecloningsites)區(qū)，但它并不破壞該基因的功能

第35頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月MultipleCloningSitespUC18pUC19第37頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC系列質(zhì)粒載體的優(yōu)點

具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)pUC8為2750bp，pUCl8為2686bppBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)的突變，導(dǎo)致rop基因的缺失適用于組織化學(xué)方法檢測重組體

LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變株與帶有完整近操縱基因區(qū)段的β—半乳糖苷酶陰性的不同突變株之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象叫做α—互補。具有多克隆位點MCS區(qū)pUC質(zhì)粒載體具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點具兩種不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到pUC質(zhì)粒載體上第39頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第40頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月利用菌落顏色篩選重組子第41頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月2、表達質(zhì)粒載體是指專用于在宿主細胞中高水平表達外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體根據(jù)表達的蛋白是否分泌到細胞外：非分泌型表達載體（胞內(nèi)表達載體）和分泌型表達載體根據(jù)表達所用的受體細胞：原核細胞表達載體和真核細胞表達載體第42頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月表達載體與克隆載體的區(qū)別強啟動子，一個可誘導(dǎo)的強啟動子可使外源基因有效的轉(zhuǎn)錄在啟動子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個好的核糖體結(jié)合位點序列（SD序列），促進蛋白質(zhì)翻譯在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個強轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和mRNA的穩(wěn)定性第43頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月表達型載體（expressionvector）

特點基因的啟動子序列和終止子序列一般無檢測標記基因克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化單元--宿主細胞轉(zhuǎn)化表達單元--外源基因表達第44頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月表達型載體（expressionvector）

類型

Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+終止子Ⅱ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子Ⅲ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號肽鏈編碼區(qū)+終止子（常稱之為表達分泌型載體）第45頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月三種表達型載體結(jié)構(gòu)圖第46頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月表達型載體（expressionvector）顯然,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之,被表達的外源基因一旦確定,表達載體的類型也就確定了。用途表達外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物用于構(gòu)建cDNA文庫第47頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月3、多功能質(zhì)粒載體載體具有多種功能，根據(jù)需要進行體外轉(zhuǎn)錄、克隆、測序、基因表達等方面的基因操作。pGEM系列質(zhì)粒載體就是一類多功能載體，如：pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM4Z、pSP64、pSP65、pGEM3Zf。第48頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月pGEM系列載體

pGEM系列載體是一種與pUC系列十分類似的小分子的質(zhì)粒載體。在其總長度為2743bp的基因組DNA中，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ’基因。在后者還插入了一段含多個限制性內(nèi)切酶的識別序列的多克隆位點。此序列結(jié)構(gòu)幾乎與pUC克隆載體的完全一樣。第49頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月pGEM3Z載體pGEM3Z與pUC載體非常相似

，其不同點：pGEM3Z含有兩段額外的短的DNA片段，每一段可以作為RNA聚合酶的識別位點。這兩段啟動子（噬菌體SP6\T7)存在于限制性內(nèi)切酶的兩端，這意味著如果在重組的pGEM3Z載體中加入RNA聚合酶，可以發(fā)生轉(zhuǎn)錄。合成的RNA可以作為探針使用，或者研究RNA的加工過程或者蛋白質(zhì)的合成。第50頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第51頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月2743bpMCSlacZ’PT7oriAprPgem-3EPSP6注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等第52頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月1、克隆載體，全長3.19kb，具有Amp抗性基因和復(fù)制起始點2、MCS兩側(cè)有SP6、T7RNA聚合酶啟動子---可進行體外轉(zhuǎn)錄；為插入片段的測序提供特異引物位點3、MCS為于lacZ’基因內(nèi)部（插入失活）—藍白斑篩選4、引入絲狀噬菌體f1(+)復(fù)制起始點-----可以產(chǎn)生單鏈DNA，并分泌至上清中，第54頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第55頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第56頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月分泌型融合表達載體，有兩個啟動子（Plac,Pspa），啟動子下游裝有SPA的信號肽序列和兩個結(jié)構(gòu)基因ZZ。產(chǎn)生與SPA蛋白ZZ段融合的蛋白，并可將融合蛋白分泌出胞4.59kb，含Amp抗性基因和原核復(fù)制起始點有f1復(fù)制起始點，可產(chǎn)生單鏈DNA第57頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月4、穿梭質(zhì)粒載體是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標記，因而可在兩種不同的宿主細胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。特點：質(zhì)粒載體可以攜帶外源DNA序列在不同物種的細胞之間，特別是在原核和真核之間往返穿梭。常見的穿梭質(zhì)粒載體：大腸桿菌-土壤農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體等。第58頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第59頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月穿梭質(zhì)粒

能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復(fù)制，又能在真核細胞(如酵母)中復(fù)制的載體。很多酵母菌的穿梭載體，用于功能互補法分離、鑒定真核生物基因的研究

第60頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)λ噬菌體載體第61頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月一、λ噬菌體的生物學(xué)特性λ噬菌體的生活周期λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)和功能λ噬菌體的DNA復(fù)制第62頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月1、λ噬菌體的生活周期l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成第63頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第64頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月2、λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)和功能l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因線狀ds-DNA，兩端具有12bp5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）該末端稱為cos位點，可被λ編碼的末端酶所識別第65頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第66頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第67頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月2、λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)和功能人為將λ噬菌體基因組分為3個區(qū)域：左側(cè)區(qū)：自基因A到基因J，包含外殼蛋白的全部編碼基因。中間區(qū)：介于基因J和基因N之間，這個區(qū)又稱為非必需區(qū)，與噬菌斑形成無關(guān)，被外源DNA片斷取代后，并不影響噬菌體的生命活動。中間區(qū)包含重組基因和一整合切割基因。右側(cè)區(qū)：位于N基因的右側(cè)，包含全部的主要調(diào)節(jié)基因及復(fù)制基因和裂解基因。第68頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月3、λ噬菌體的DNA復(fù)制裂解周期早期：環(huán)狀的λDNA分子按θ型雙向復(fù)制，復(fù)制起點位于O基因內(nèi)，需要O、P基因編碼蛋白的參與。晚期：控制滾環(huán)型復(fù)制的開關(guān)被啟動，復(fù)制從θ型轉(zhuǎn)變?yōu)闈L環(huán)型復(fù)制，合成出一系列λDNA線性排列的多聚體分子。cos位點是λ噬菌體正確包裝的必需位點。第69頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第70頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月3、λ噬菌體的DNA復(fù)制溶原性周期λDNA復(fù)制以另外一種形式進行，穩(wěn)定的整合到宿主染色體上并隨之一起復(fù)制。cI基因表達，合成參與溶菌周期活動的所有基因被阻遏的蛋白質(zhì)。附著位點att，同大腸桿菌染色體DNA的局部同源位點之間的重組反應(yīng)實現(xiàn)。原噬菌體的刪除作用整合作用需要int基因的表達，是一種可逆的過程：一方面，噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNA上，成為原噬菌體；另一方面，在適當(dāng)條件下，原噬菌體又可以脫離宿主主染色體，重新變成獨立的復(fù)制子，這種過程叫做原噬菌體的刪除作用。λ噬菌體的刪除，需要噬菌體xis基因和int基因的協(xié)同作用才能實現(xiàn)。第71頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月二、

λ噬菌體載體的構(gòu)建（一）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本原理（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容1、除去多余的限制酶識別位點2、切除掉λDNA的非必需區(qū)3、引入適當(dāng)?shù)倪x擇標記4、引入無義突變第72頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本原理野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因λDNA基因組中同一種限制酶具有多個識別位點，不利于外源DNA插入—體內(nèi)突變和建立新的克隆位點。λ噬菌體頭部只能容納自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ僅可插入2.5Kb外源DNA片段—除去所有與λ裂解無關(guān)的基因和空白區(qū)，最大可插入22Kb。第73頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第74頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容1、除去多余的限制酶識別位點天然的λ-DNA上有多個酶切位點，如：EcoRI5個，HindIII7個，這些多余的酶切位點必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細胞的λDNA分子會被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點缺失了。第75頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月通過自然選擇法篩選無EcoRI識別位點的λ-噬菌體

第76頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容插入型載體只具有一個限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點可供外源DNA插入的λ噬菌體派生載體承載10Kb以內(nèi)外源DNA片斷取代型載體具有兩個限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點，它們之間的DNA片斷可被外源DNA片斷取代承載20Kb左右外源DNA片斷有多克隆位點，即可用作插入型又可用作取代型第77頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度插入型載體第78頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度取代型載體第79頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容2、切除掉λDNA的非必需區(qū)載體經(jīng)改造后的長度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長，使用時用酶切開，分離去除這個14kb長的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。40-14kb=26kb包裝下限為36.4kb，因此其載裝下限為10.4而上限為25.5kb。不再需要標記基因，因為空載的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無法進入受體細胞中去第80頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容3、引入適當(dāng)?shù)倪x擇標記通過組織化學(xué)方法進行重組子的篩選加裝選擇標記lacZ不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標記imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的l-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，l-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑第81頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）構(gòu)建λ噬菌體載體的基本內(nèi)容4、引入無義突變琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株第82頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月三、常用的λ噬菌體載體插入滅活型載體

Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑第83頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第84頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第85頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)單鏈DNA噬菌體載體優(yōu)越性能克隆較大的DNA片斷，包裝M13DNA的6倍產(chǎn)生大量含有外源DNA序列的單鏈DNA分子測定外源DNA片斷的插入方向可從大腸桿菌中制備雙鏈的復(fù)制型DNA兩種形式的DNA分子都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌，或產(chǎn)生噬菌斑第86頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月一、M13噬菌體的生物學(xué)特性（一）M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)（二）M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝第87頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ編碼特異性蛋白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝基因Ⅱ參與DNA復(fù)制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ編碼M13的結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅴ參與單鏈復(fù)制過程中的環(huán)化作用基因Ⅵ是衣殼蛋白的重要組成部分第88頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker第89頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝復(fù)制過程：ss（+）RF(0-1min)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)DNA包裝無嚴格限制第90頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV感染周期第91頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第92頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月二、M13噬菌體載體的構(gòu)建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)域，因而載體的構(gòu)建主要是插入標記基因如，lacZ'、多克隆位點，消除多余的酶切位點。在M13上引入lacZ’基因，產(chǎn)生了M13mp1，這樣就可以通過插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點的的識別序列，在基因的起始端，含有6堿基的序列GCATTC，是一個EcoRI位點，這是通過體外定點突變獲得的，產(chǎn)生了M13mp2。M13mp2是最簡單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點，在X-gal培養(yǎng)基上可以很容易的區(qū)別出來。

M13載體的構(gòu)建的第二步是將限制性內(nèi)切酶位點引入lacZ’基因，這一步是通過合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點上，就產(chǎn)生了M13mp7。第93頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第94頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第95頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第96頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月CoordinatesofM13mp18/19genes(terminationcodonsincluded):I3196-4242

II6849-831

III1579-2853

IV4220-5500

V843-1106

VI2856-3194

VII1108-1209

VIII1301-1522

IX1206-1304

X496-831M13mp18M13mp19第97頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月三、M13噬菌體載體的主要功能最為顯著的優(yōu)點是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，用途：

（1）用于雙脫氧末端終止測定DNA順序

（2）用于單鏈DNA的定點誘變

（3）用于合成探針第98頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第99頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月四、噬菌粒（Phagemid）載體

質(zhì)粒與M13-DNA的重組體帶有質(zhì)粒上的酶切位點及標記基因，這樣更于篩選及克隆由于不含包裝蛋白基因，載體本身長度減少，裝載量增大，比質(zhì)粒大，但不及λ-DNA。第100頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第101頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第102頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第103頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)粘粒載體（cos質(zhì)粒載體）第104頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)粘粒載體（cos質(zhì)粒載體）l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進一步提高噬菌體DNA考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體第105頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)粘粒載體（cos質(zhì)粒載體）能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞第106頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第107頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第108頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)其他載體一、人工染色體二、植物基因工程載體三、動物基因工程載體第109頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母人工染色體第110頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌人工染色體

YAC可接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點使YAC成為人類基因組計劃及圖位克隆分離基因的重要工具第111頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌人工染色體YAC載體應(yīng)含有下列元件：酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復(fù)制子酵母染色體的中心粒序列酵母系統(tǒng)的選擇標記大腸桿菌的復(fù)制子大腸桿菌的選擇標記YAC載體的裝載量為100-2000kbpYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1第112頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉(zhuǎn)化酵母菌重組酵母染色體第113頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月細菌人工染色體很多真核生物基因長度在50kb以上。細菌人工染色體(BAC)載體就是為克隆更大的外源DNA片段而設(shè)計構(gòu)建的

細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300kb之間第114頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月載體容量M13mp載體<4kb細菌質(zhì)粒載體<10kbλ載體<23kbcos質(zhì)粒載體<48kbP1載體<95kbpYAC載體∽1000kb

第115頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月PlantcloningvectorsTi質(zhì)粒:侵染廣泛的雙子葉植物T-DNA或T-區(qū)(T-region)：約20kb，包含?；诎`堿生化合成和冠癭瘤生長的基因，隨機地整合到植物染色體上。結(jié)構(gòu)特點：兩端具有25個堿基對的順向重復(fù)序列，但重復(fù)不是完全的。25個堿基對的序列稱為T-DNA的邊界序列(T-DNAbordersequence)。去除右邊界序列，將使T-DNA失去轉(zhuǎn)移和整合的功能；左邊界的缺失，對致瘤性無明顯影響。毒性區(qū)域即vir(virulence)區(qū)域:引起T-DNA轉(zhuǎn)移的區(qū)域。長度約35kb，和T-DNA處于不同位置第116頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒包括五個區(qū)域1.LB與RB之間的T-DNA，這段序列整合到植物基因組中2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)3.冠癭堿代謝區(qū)4.復(fù)制原點5.毒性區(qū)第117頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒及其衍生載體T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。第118頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對其加以改造，構(gòu)建出Ti質(zhì)粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細菌選擇標記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標記，pUC19的多克隆位點及α-互補顯色標記（2）共整合載體(integratedvectors)第119頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月CaMV克隆載體含1個約8kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子；用于十字花科和少數(shù)非十字花科的植物基因轉(zhuǎn)移；其感染對植物有害，不能直接做載體；CaMV的DNA在植物細胞中能高水平轉(zhuǎn)錄35SRNA，其啟動子是一強啟動子。構(gòu)建的含35S啟動子的系列克隆載體可在植物細胞內(nèi)高效表達基因。第120頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月第121頁，課件共129頁，創(chuàng)作于2023年2月Cloningvectorsofanimalcell動物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物5243bp共價閉合環(huán)狀分子感染率高，幾乎100％寄主細胞能被感染能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分侵染性具有寄主特異性改建：野生型最多只能包裝其基因組長度的1.05倍的DNA分子其他：痘苗病毒DNA作載