通心絡(luò)與阿托伐他汀、阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用對(duì)apoe-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響

通心絡(luò)與阿托伐他汀、阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用對(duì)apoe--小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響

動(dòng)脈硬化（as）是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。脂質(zhì)代謝異常和炎癥反應(yīng)對(duì)as病變的發(fā)生和腫瘤的形成起著重要作用：1）。降脂類他汀藥和抗血小板聚集藥阿司匹林均具有一定的抑制AS炎癥反應(yīng)的作用［2－3］,是目前AS患者使用最廣泛的兩種藥物。通心絡(luò)是近年來臨床上廣泛用于防治心腦血管病的中成藥,具有內(nèi)皮保護(hù)和穩(wěn)定易損斑塊的作用,可通過調(diào)脂、抗炎、抗氧化等多重作用機(jī)制發(fā)揮抗AS的作用［4］,且可以有效改善阿司匹林抵抗［5］,增強(qiáng)他汀降脂效果,療效互補(bǔ)［6］。上述3種藥物在心腦血管疾病的防治中各有特長,作用互補(bǔ)。近年來有人提出固定劑量的聯(lián)合用藥即polyp-ill的策略［7］,長期預(yù)防用藥,可以達(dá)到防治疾病的效果?；谏鲜鲅芯?有學(xué)者提出阿司匹林(A)、通心絡(luò)(T)、他汀(S)聯(lián)合應(yīng)用防治心腦血管疾病的“金三角”方案(ATS),并取得明顯的臨床療效［8］。但是該方案對(duì)ApoE－/－小鼠AS病變的影響研究國內(nèi)報(bào)道甚少。因此本研究著重從脂質(zhì)代謝和炎性反應(yīng)角度探討該方案抑制AS的作用,揭示3種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的療效優(yōu)勢。1高脂飼料的組成與膜組as1.1動(dòng)物ApoE－/－小鼠140只,8周齡,♂,體質(zhì)量20~22g,北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(京)2006-0008。同遺傳背景C57BL/6J小鼠20只,8周齡,♂,體質(zhì)量20~22g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(京)2006-0009。飼養(yǎng)在河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理屏障實(shí)驗(yàn)室,光照12h·d－1,溫度20℃~23℃,相對(duì)濕度40%~60%。1.2藥物通心絡(luò)超微粉(Tongxinluo):由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成,1.46g生藥/g超微粉,石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)20101016);阿托伐他汀(立普妥):20mg/片,7片裝,大連瑞輝制藥有限公司,批號(hào):031711k;腸溶阿司匹林片:100mg/片,100片裝,拜耳醫(yī)藥保健公司提供,批號(hào):018110303。1.3主要試劑與儀器TC、TG、HDL、LDL試劑盒,(北京九強(qiáng)生物);高敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)試劑盒(南京建成);兔抗鼠胞間黏附分子(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)及單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)多克隆抗體(SantaCruz);7080型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立);WellscanMK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(芬蘭LabSystemsDragon);凝膠成像分析儀(美國Biorad)1.4方法1.4.1造模與分組給藥方法140只ApoE－/－小鼠隨機(jī)分為模型組(AS)、阿托伐他汀組(ATO)、阿司匹林組(ASP)、通心絡(luò)組(TXL)、ATO聯(lián)合ASP組(A+A)、3藥聯(lián)用低劑量組(ATS-L)及高劑量組(ATS-H),每組20只,均連續(xù)給予高脂飼料［9］(熱量組成:碳水化合物20.1%,脂肪59.8%,蛋白質(zhì)20.1%)。同時(shí)選取同遺傳背景C57BL/6J小鼠20只,作為正常對(duì)照組(CON)。其中ATO組以6.0mg·kg－1·d－1灌胃(擬臨床人用量40mg·d－1);ASP組以25mg·kg－1·d－1灌胃(擬臨床人用量150mg·d－1);TXL組以1.5g超微粉·kg－1·d－1灌胃(擬臨床人用劑量4.56g生藥/d);A+A組以ATO6.0mg·kg－1·d－1加ASP25mg·kg－1·d－1灌胃;ATS-L組以ATO3.0mg·kg－1·d－1加TXL1.5g·kg－1·d－1加ASP12.5mg·kg－1·d－1灌胃;ATS-H組以ATO6.0mg·kg－1·d－1加TXL1.5g·kg－1·d－1加ASP25mg·kg－1·d－1灌胃;CON組和AS組以等體積的生理鹽水灌胃,12周后,禁食,常規(guī)處死,進(jìn)行檢測。1.4.2主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)?處死小鼠,左心室灌流PBS,心耳下方切開小鼠心臟,分離主動(dòng)脈根,10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色觀察血管病理形態(tài)變化。1.4.3血清脂質(zhì)成分測定實(shí)驗(yàn)?zāi)?禁食12h,1%戊巴比妥腹腔麻醉小鼠,眼眶后取血,4℃,3000r·min－1,離心10min,取上清分裝,酶比色法測定血清TC、TG、LDL、HDL水平。1.4.4血清hs-CRP測定取分裝血清,雙抗夾心ELISA法測定hs-CRP水平,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。1.4.5Westernblot主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)?麻醉取血處死小鼠,左心室灌流PBS,自主動(dòng)脈起始部仔細(xì)解離主動(dòng)脈至腹主動(dòng)脈的髂動(dòng)脈分叉處,液氮保存。取血管約0.1g,提取總蛋白后,Nanodrop2000分光光度計(jì)蛋白定量,SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),半干轉(zhuǎn)膜后,含5%脫脂奶粉的TTBS封閉2h,加入TTBS稀釋(1∶500)的一抗溶液/β-actin(1∶1000)4℃,過夜。脫色搖床上用TT-BS室溫洗膜3次,每次10min。加入TTBS1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2h。TTBS洗膜同上,化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。照相保存,用ImageJ軟件分析條帶灰度值。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以u(píng)e0af±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩間比較采用LSD法檢驗(yàn)。2各組小鼠血脂指標(biāo)比較2.1各組小鼠主動(dòng)脈病理改變比較CON組:動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整,壁薄,管腔未見狹窄及脂紋斑塊。AS組模型組內(nèi)皮脫落,呈不連續(xù)缺失,內(nèi)皮下及中膜大量泡沫細(xì)胞堆積,管腔狹窄及斑塊形成明顯;各用藥組上述病理損傷均可見不同程度的減輕,其中ATS-H組病損明顯減輕,泡沫細(xì)胞數(shù)量明顯減少,斑塊明顯消退,優(yōu)于模型組及其他用藥組(Fig1)。2.2各組小鼠血脂水平比較與CON比較,AS組血清TC、TG、LDL均明顯升高(P<0.01),HDL明顯降低(P<0.01);與AS組比較,除ASP組外,其余各用藥組TC、TG、LDL均明顯降低(P<0.01),HDL-C均明顯升高(P<0.01),其中TXL降低TC、TG、LDL,升高HDL水平與ATO、A+A作用相當(dāng)(P>0.05),ATS-L、ATS-H組在降低TC、TG、LDL,升高HDL方面能力明顯優(yōu)于單用ATO、TXL及A+A組(P<0.05,P<0.01),而AST-H在降低TC、LDL,升高HDL方面優(yōu)于ATS-L組(P<0.05)(Tab1)。2.3各組小鼠血清hs-CRP水平比較與CON組比較,AS組血清hs-CRP水平明顯升高(P<0.01);與AS組比較,各用藥組均能不同程度的降低hs-CRP水平(P<0.05或P<0.01),其中ATO、ASP、TXL3組間hs-CRP水平無明顯差異(P>0.05),A+A及ATS-L組hs-CRP水平均明顯低于ATO、ASP、TXL3組(P<0.05),但均高于ATS-H組(P<0.05),見Fig2。2.4各組小鼠主動(dòng)脈組織ICAM-1、VCAM-1、MCP-1蛋白表達(dá)比較與CON組比較,AS組小鼠主動(dòng)脈ICAM-l、VCAM-l、MCP-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);與模型組比較,各用藥組上述指標(biāo)的蛋白表達(dá)均有不同程度的下調(diào)(P<0.05或P<0.01),其中ATO、ASP、TXL組上述蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05),A+A及ATS-L組上述蛋白表達(dá)均明顯低于ATO、ASP、TXL3組(P<0.05或P<0.01),但均高于ATS-H組(P<0.05),見Tab3,Fig2。3對(duì)as治療的效果ApoE-/－小鼠由于缺乏載脂蛋白E使低密度脂蛋白代謝障礙,易于沉積管壁,因而可自發(fā)形成AS病灶,其AS病理形態(tài)較其他動(dòng)物模型更接近于人類［10］,目前已成為國內(nèi)外研究AS發(fā)病機(jī)制和干預(yù)措施較理想的動(dòng)物模型。本研究采用高脂誘導(dǎo)ApoE－/－小鼠建立AS模型,結(jié)果顯示經(jīng)高脂喂飼12周后,模型組血清TC、TG、LDL水平均明顯升高,HDL水平明顯降低,HE染色顯示主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫、內(nèi)皮下有大量泡沫細(xì)胞聚集、斑塊形成明顯;本研究結(jié)果顯示通心絡(luò)可明顯降低血清TC、TG、LDL水平,升高HDL水平;與阿托伐他汀、阿司匹林聯(lián)用不僅可增強(qiáng)調(diào)脂療效,明顯降低AS致病因素;同時(shí)還可有效改善AS病理損傷,延緩AS斑塊的形成,起到綜合調(diào)治效應(yīng)。AS是內(nèi)皮損傷后的炎癥反應(yīng)及在此基礎(chǔ)上的損傷-修復(fù)過程已得到證實(shí)［11］。研究表明［12］,C反應(yīng)蛋白(CRP)是AS炎癥反應(yīng)中的敏感性標(biāo)志物,不僅在預(yù)測心血管事件的發(fā)生和預(yù)后方面價(jià)值較高,同時(shí)也是AS的致病因素,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1、ICAM-1等黏附分子表達(dá)及MCP-1的分泌［13］。MCP-1對(duì)單核細(xì)胞有趨化和激活作用,介導(dǎo)單核細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移［14］,VCAM-1、ICAM-1則可觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞與多種白細(xì)胞、單核細(xì)胞的黏附,從而啟動(dòng)或加速AS的發(fā)展［15］。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠血清hs-CRP水平明顯升高,同時(shí)主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1、MCP-l蛋白表達(dá)明顯上調(diào),提示hs-CRP啟動(dòng)VCAM-1、ICAM-1及MCP-l蛋白表達(dá)在主動(dòng)脈粥樣硬化過程中發(fā)揮了重要作用;本研究結(jié)果顯示通心絡(luò)、阿托伐他汀及阿司匹林干預(yù)后均能不同程度地降低血清hs-CRP水平,下調(diào)ICAM-1、VCAM-1、MCP-l的表達(dá),減輕AS炎性反應(yīng),這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［16