rp-hplc法測(cè)定木豆葉中球松素的含量

rp-hplc法測(cè)定木豆葉中球松素的含量

木豆葉，又名柳豆葉，來(lái)自科豆科植物cajanacanan（l.）milsp干燥葉?；粗参锬径乖谖覈?guó)海南、廣東、廣西、四川、云南、福建及臺(tái)灣等省區(qū)均有栽培,資源豐富。木豆葉有解痘毒、消炎腫之功效,現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)與臨床研究提示該藥對(duì)骨及軟組織感染等疾病有顯著的療效,且使用安全。廣州中醫(yī)藥大學(xué)與浙江海正藥業(yè)在此基礎(chǔ)上將木豆葉開發(fā)成為治療股骨頭缺血性壞死的藥物“通絡(luò)生骨膠囊”,臨床治療股骨頭壞死安全有效。目前對(duì)木豆葉藥材的質(zhì)量研究尚欠缺。我們參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)從木豆葉藥材中分離得到異美五針?biāo)啥潼S酮(Pinostrobin,球松素)作為對(duì)照品,采用高效液相色譜法對(duì)不同木豆葉藥材樣品中的含量進(jìn)行了分析。1儀器和試劑盒1.1儀器、試藥和儀器DIONEXSUMMIT高效液相色譜儀(P680HPLC四元梯度泵、STH585柱溫箱、PDA-100檢測(cè)器、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器);Chromeleon色譜工作站;KQ3200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲儀;艾科浦U系列試驗(yàn)室專用超純水機(jī)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司);SartoriusCT225D電子分析天平。1.2木豆及球松素對(duì)照品木豆葉3批,批號(hào):090811、090812、090813,購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大藥房,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)蘇子仁研究員鑒定為豆科植物木豆Cajanuscajan(L.)Millsp.的干燥葉;球松素對(duì)照品,自制(純度≥99.0%,中國(guó)廣東分析測(cè)試中心測(cè)定);試劑:超純水、甲醇(色譜純、分析純),乙醇(分析純)。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相、柱溫色譜柱:PhenomenexlunaC18柱(250mm×4.60mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-水,梯度洗脫,洗脫程序見(jiàn)表1;流速:1.0mL·min-1;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為287nm。理論板數(shù)按球松素峰計(jì)算均不低于10000。在以上色譜條件下,木豆葉中的球松素與其他組分的色譜峰分離度良好。見(jiàn)圖1。2.2對(duì)照品儲(chǔ)備液精密稱取球松素對(duì)照品0.01081g,置10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,得球松素對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.081mg·mL-1)。分別精密吸取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.5mL球松素對(duì)照品儲(chǔ)備液至10mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,即得不同濃度的球松素對(duì)照品溶液(0.011mg·mL-1～0.162mg·mL-1)。2.3超聲處理法取木豆葉,粉碎,取約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,稱定重量,超聲處理30min(功率250W,頻率50kHz),放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,以0.45μm微孔濾膜濾過(guò),即得。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取不同濃度的球松素對(duì)照品溶液,進(jìn)樣10μL,按上述色譜條件測(cè)定峰面積,并以濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,球松素在0.011mg·mL-1～0.162mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=568.06X-0.76,r=0.9999。2.6進(jìn)樣穩(wěn)定性測(cè)定取同一批木豆葉樣品(批號(hào):090811)按供試品制備方法制成供試品溶液,分別于第0h、2h、4h、6h、12h、24h進(jìn)樣10μL,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得球松素的平均峰面積為15.705,RSD為1.41%,結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批木豆葉樣品(批號(hào):090811),按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液,分別進(jìn)樣10μL,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算測(cè)得球松素的平均含量為2.613mg·g-1,RSD為1.49%,結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。2.8對(duì)照品溶液的制備取已知含量的木豆葉樣品(批號(hào):090811),粉碎,取約0.25g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入球松素對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.081mg·mL-1)0.3mL、0.5mL、0.8mL,按供試品制備方法制備。每一濃度平行操作3份,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得球松素平均回收率為100.13%,RSD為1.01%,結(jié)果見(jiàn)表2。2.9樣品含量的測(cè)量3討論2.5主要提取溶劑及提取方法的選擇精密吸取濃度為0.043mg·mL-1的球松素對(duì)照品溶液10μL,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,重復(fù)6次,測(cè)得球松素的平均峰面積為24.462,RSD為1.23%,說(shuō)明本方法精密度良好。取3批木豆葉樣品,按供試品制備方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣10μL,并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算各批木豆葉中球松素的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。3.1在提取溶劑的選擇上,分別考察了甲醇、75%乙醇、乙酸乙酯。結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用甲醇作為提取溶劑能有效提取出木豆葉中的球松素,故選用甲醇作為提取溶劑。在提取方法的選擇上,考察了加熱回流及超聲處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者對(duì)球松素的提取效果沒(méi)有明顯差異。考慮到超聲處理