紫杉醇的提取與研究

紫杉醇的提取與研究

20世紀(jì)60年代初，從太平洋紫杉中分離出2類化合物。這是治療各種癌癥（包括宮頸癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌和與艾滋相關(guān)的卡波西癌）的最佳藥物。事實上,紫杉醇還可用于冠心病(CHD)的治療,以減少氣囊血管形成術(shù)后疤痕組織的形成;也可制成紫杉醇洗脫支架,可明顯降低冠脈介入術(shù)后冠狀動脈內(nèi)支架的再狹窄比率。隨著可被心血管支架治療的冠心病病例的增加,對紫杉醇的需求可能會更加迫切。由10-脫?；涂ㄍあ?10-DAB)、巴卡亭Ⅲ(BacatinⅢ)、三尖杉寧堿、10-脫?；馍紝帀A、7-木糖紫杉醇、10-脫?；仙即肌?-木糖-10-脫?；仙即肌?-戊醛基-10-脫?；仙即嫉葹榍绑w化學(xué)半合成已取得了巨大成功,但其中的一些物質(zhì)如10-DAB和BacatinⅢ仍來源于紅豆杉植物,無法從根本上解決紫杉醇藥源稀缺的問題。微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的研究盡管取得了很大的進展,但大多仍停留在實驗室研究階段,分離到的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌發(fā)酵液中紫杉醇的產(chǎn)量很低,難以達到工業(yè)化生產(chǎn)的最低要求。目前紫杉醇主要從紅豆杉樹皮中分離提取,但紅豆杉種質(zhì)資源匱乏,且紫杉醇僅占樹皮干重的0.017%,因此采用植物細胞工程技術(shù)被認為是提高紫杉醇產(chǎn)率、緩解對紅豆杉稀缺資源保護的壓力、解決紫杉醇藥源緊缺的一種最有效方法。本文從植物細胞培養(yǎng)方面對紫杉醇的生產(chǎn)技術(shù)進行全面分析討論,以期為實現(xiàn)紫杉醇的規(guī)?；囵B(yǎng)提供參考。1誘導(dǎo)愈傷組織生長由于紅豆杉細胞之間結(jié)合較為緊密,細胞增殖較慢等條件的限制,一般不采用機械分離法而采用誘導(dǎo)愈傷組織的方法制備懸浮細胞。短葉紅豆杉(T.brevifoliaNutt.)、歐洲紅豆杉(Taxusbaccata)、東北紅豆杉(Taxuscuspidata)、曼地亞紅豆杉(Taxusmedia)、加拿大紅豆杉(Taxuscanadensis)、喜馬拉雅紅豆杉(Taxuswallichiana)、中國紅豆杉(Taxuschinensis)、南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)、云南紅豆杉(Taxusyunnanensis)和墨西哥紅豆杉(Taxusglobosa)均可誘導(dǎo)形成愈傷組織。原材料的選擇對誘導(dǎo)率和紫杉醇產(chǎn)量均有較大影響,而且枝段的誘導(dǎo)率要高于葉片,而老枝的紫杉醇含量則明顯高于嫩枝。誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基一般采用MS或B5培養(yǎng)基,植物組培常用激素均可誘導(dǎo)紅豆杉形成愈傷組織,但需生長素和分裂素配合使用,激素濃度一般控制在1.0~3.0mg/L范圍內(nèi)。翟雪霞等以太行紅豆杉(屬南方紅豆杉)為材料,探索了誘導(dǎo)愈傷組織不同激素最佳配比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)B5+NAA(1.0mg·L-1)+6-BA(0.5mg·L-1)+2,4-D(1.0mg·L-1)為紅豆杉最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)率高達100%。誘導(dǎo)出的愈傷組織仍較緊密,需經(jīng)多次傳代培養(yǎng)至松散狀態(tài)方可用于懸浮培養(yǎng),一般采用B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,且培養(yǎng)基中氮源的還原態(tài)和氧化態(tài)的相對含量對細胞生長影響較大,提高培養(yǎng)基中的NH4NO3可以明顯提高培養(yǎng)細胞的生長速率。生長素與細胞分裂素的不同組合,顯著影響愈傷組織的生長。孫珺等發(fā)現(xiàn)以10mg/LNAA和2.0mg/L6-BA的配比組合為紅豆杉愈傷組織生長增殖的最佳條件。而翟雪霞等的研究則認為B5+2,4-D為太行紅豆杉細胞系最佳繼代培養(yǎng)基,生長量最高可達0.30g/g(鮮重)。2培養(yǎng)基的篩選進入懸浮培養(yǎng)階段,常采用B5液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。Toshio等考察了6種培養(yǎng)基(B5C2,S2FG,SH,S8,F4,F4G4)對矮紫杉(Taxuscuspidatavar.nana)懸浮細胞系產(chǎn)紫杉醇的影響,發(fā)現(xiàn)F4G4效果最好,紫杉醇含量可達0.055%。2.1紫杉醇合成的前體物質(zhì)植物中存在著兩條合成萜類代謝的前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(IPP)的途徑,即胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)典的甲羥戊酸途徑(MVA途徑),以及存在于質(zhì)體中的和甘油醛磷酸/丙酮酸途徑(DXP途徑)。研究表明,紫杉醇的三環(huán)二萜骨架、C10位的乙酰基以及C13位的?；鶄?cè)鏈分別來自羥甲基戊酸(MVA)、乙酸和苯丙氨酸(Phe),而其雙萜類母核合成所用的異戊二烯是由葡萄糖的初級代謝產(chǎn)物-磷酸丙糖與丙酮酸脫羧產(chǎn)物縮合后產(chǎn)生。因此,莽草酸合成途徑、EMP途徑、MVA途徑、DXP途徑以及與乙酰CoA合成有關(guān)的代謝途徑均會影響紫杉醇的合成效率。在培養(yǎng)體系中添加這些前體物質(zhì)或能提高這些前體合成量的物質(zhì)可加大紫杉醇的合成量,且最好選用G為碳源。另外,一些碳源如蔗糖、麥芽糖、D-果糖等,對紅豆杉細胞生長和紫杉醇累積也有明顯的影響。2.2紫杉醇提高細胞紫杉醇含量的常用植物誘導(dǎo)藥物誘導(dǎo)子是植物抗病生理過程中誘發(fā)植物產(chǎn)生抗毒素和引起超敏反應(yīng)的因子,包括侵染植物的微生物及植物細胞內(nèi)的分子?？烧T導(dǎo)提高細胞紫杉醇含量的物質(zhì)很多,大體上可分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子,生物誘導(dǎo)子即各種真菌提取物,非生物誘導(dǎo)子主要指各種植物生長調(diào)節(jié)劑(茉莉酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、花生四烯酸等)以及以Ag和稀土元素為代表的各類重金屬鹽。大量研究表明,單獨使用各類誘導(dǎo)子可明顯提高紫杉醇及其衍生物的含量。2.2.1國內(nèi)杉木細胞誘導(dǎo)子誘導(dǎo)真菌誘導(dǎo)子是一類誘導(dǎo)植物細胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成的混合物,包括真菌菌體、菌液濃縮物、菌絲和菌液提取物以及菌絲體處理的可溶性成分、細胞壁降解成分、肽類和蛋白質(zhì)等。這類物質(zhì)可在植物與真菌的相互作用中快速、高度專一和選擇性地誘導(dǎo)植物特定基因的表達,進而活化特定的次級代謝途徑,積累特定的代謝產(chǎn)物。近年來關(guān)于這方面研究成果基本集中在國內(nèi):Wang等用黑曲霉直接作為誘導(dǎo)子加入到中國紅豆杉懸浮細胞系中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對數(shù)生長期后期添加40mg的真菌誘導(dǎo)子后,細胞總代謝產(chǎn)物提高了約6倍,而紫杉醇含量則提高了2倍多;李永成等用產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌(Fusariummairei)的B5培養(yǎng)液為誘導(dǎo)子,結(jié)果顯示,在培養(yǎng)的第10天添加4mL內(nèi)生真菌培養(yǎng)液,東北紅豆杉細胞懸浮液的紫杉醇產(chǎn)量最高為5.88mg·L-1;張長平等采用尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)胞壁成分粗提物(FM)為誘導(dǎo)子,在培養(yǎng)的指數(shù)生長末期的第18天加入,發(fā)現(xiàn)60mg·L-1的FM可在誘導(dǎo)后的第4天使紫杉醇產(chǎn)量達到最高峰值,為67mg·L-1,是對照組的5倍。其后續(xù)研究表明,紫杉烷類化合物10-DAB和BacatinⅢ的合成量峰值出現(xiàn)在添加誘導(dǎo)子的第3天,之后則呈下降趨勢,說明真菌誘導(dǎo)子不僅加強了紫杉烷類的合成,而且提前了紫杉烷類的合成時間。Sangram等通過基因本體(GO)分析不同培養(yǎng)時期獲得的東北紅豆杉P991細胞系建立的抑制性消減雜交(SSH)cDNA文庫,結(jié)果顯示MeJA誘導(dǎo)下的紫杉醇合成基因表達量增加。2.2.2a、真菌誘導(dǎo)物、茉莉酸甲酯茉莉酸(JA)是植物體內(nèi)的一種重要信號分子,在植物抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要的作用,JA以及茉莉酸甲酯(MeJA)還是一類常用的促進植物細胞次生代謝產(chǎn)物合成的化學(xué)誘導(dǎo)物。次生代謝產(chǎn)物合成和JA積累是植物細胞在真菌誘導(dǎo)子等外界因子刺激下普遍產(chǎn)生的早期反應(yīng)。黃雅芬等發(fā)現(xiàn)MeJA和真菌誘導(dǎo)子均可提高細胞內(nèi)脂氧合酶(LOX)的活性和紫杉醇的產(chǎn)量,而誘導(dǎo)前用LOX抑制劑菲尼酮處理則可抑制LOX活性和紫杉醇合成,推斷MeJA可能是通過激活細胞內(nèi)LOX途徑而啟動下游紫杉醇的合成。另外,MeJA能夠提高細胞色素P450單氧酶的活性,而向紫杉醇及其衍生物骨架引入氧原子的所有羥氧化均由細胞色素P450單加氧家族酶催化完成,包括C13位和C14位羥化酶。因此誘導(dǎo)物MeJA的添加可以提高紫杉醇和紫衫烷的合成效率。高明波等采用XAD-7作吸附劑,與MeJA聯(lián)合使用,使中國紅豆杉懸浮細胞的紫杉烷C(Tc)產(chǎn)量提高至477.4mg·L-1,為對照組的6.3倍,其中94%的Tc被樹脂所吸附。Zhang等向Taxuscuspidate懸浮培養(yǎng)體系中分別添加4種誘導(dǎo)子:MeJA、H2O2、JA以及真菌誘導(dǎo)子(F3),結(jié)果顯示10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(BAPT)和細胞色素P450單氧酶均有提高,并且紫杉醇產(chǎn)量亦隨之增加。2.2.3評結(jié)成果獲得的驗證水楊酸(SA)是一種普遍存在于植物的小分子酚類內(nèi)源激素,它能夠激活植物過敏反應(yīng)(HR)和系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的內(nèi)源信號分子,可作為植物抗病反應(yīng)所需的信號分子來激活植物防御保護機制。而紫杉醇本身就是紅豆杉屬植物為抵御外源物質(zhì)侵害而由植物防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,因此適量的SA從理論上可以增加紫杉醇的產(chǎn)量,這一結(jié)論已獲得國內(nèi)外眾多研究者的證實。Wang等認為20mg·L-1的SA是減少對紅豆杉細胞損傷的最佳濃度,并且SA可激活苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性,在10nmol/L輔酶Ⅱ(NADPH)抑制劑美伐他汀(mevastatin)的作用下,南方紅豆杉細胞中紫杉醇含量(干重)仍可達1.626mg/g。Qian等的研究則發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)了12d的中國紅豆杉中添加100μmol/L的茉莉酸甲酯類似物-茉莉酸甘油(DHPJA),云南紫杉烷C(Tc)產(chǎn)量可提高至827±29mg·L-1,是不加誘導(dǎo)子的5.4倍,在搖瓶培養(yǎng)體系中可達738±41mg·L-1,向培養(yǎng)了12d的中國紅豆杉中添加100μmol/L的DHPJA,Tc在氣升式反應(yīng)器中可達33.2±1.9mg/L。Wang等發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的第8天、第14天和第20天的時候向懸浮培養(yǎng)體系中添加MeJA,其Tc產(chǎn)量是搖瓶培養(yǎng)的1.5~1.6倍,在培養(yǎng)的第8天、第14天和第20天的時候向懸浮培養(yǎng)體系中添加MeJA,其Tc產(chǎn)量是單獨向1.0L氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)的第8天添加的1.8倍。2.2.4植物基金屬酶于1996年發(fā)現(xiàn)的一種植物多肽生長激素-植物硫化激動素(phytosulfokine-α,PSK-α)是廣泛存在植物體內(nèi)一種硫酸酯化5肽生長調(diào)節(jié)因子,具有促進細胞增殖等多種生物活性。Kim等研究發(fā)現(xiàn),PSK-α受紅豆杉植物種類影響很大,它可促進加拿大紅豆杉(T.canadensis)細胞生物量的累積,而對東北紅豆杉無明顯作用,100nmol/L的PSK-α和100mmol/L的MeJA聯(lián)合使用可使T.canadensis細胞系(C93AD)的紫杉醇含量(干重)達到35.3mg/g。有研究表明,稀土誘導(dǎo)子硝酸鈰、硝酸鈰銨、硝酸鑭可提高紫杉醇前體物質(zhì)10-DAB含量。李干雄等發(fā)現(xiàn)AgNO3、SA、氨基酸前體、D-果糖和硫酸鑭,都能明顯促進中國紅豆杉細胞合成紫杉醇,這些促進劑的添加時間對中國紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)的生長沒有明顯的影響,但能明顯促進紫杉醇的合成,當(dāng)在細胞培養(yǎng)的第14天添加1.67mg/LAgNO3,第18天添加0.1mg/LSA,第21天添加氨基酸前體,第21天添加10g/LD-果糖和2mg/L硫酸鑭時對紫杉醇的促進作用最明顯,此時紫杉醇含量達到10.05mg/L。2.3紫杉醇合成的代謝抑制劑及途徑研究添加代謝支路抑制劑可抑制分支路徑,減少其他次級代謝產(chǎn)物的合成,使代謝流更多地向紫杉醇及其衍生物方向匯集,從而提高紫杉醇類的合成量。研究表明,在植物體內(nèi)赤霉素(GA)可以通過前饋或反饋來調(diào)節(jié)GA合成途徑中的許多關(guān)鍵酶,控制赤霉素的代謝。紅豆杉植株經(jīng)GA處理后,由牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)向赤霉素類化合物的合成可能也被抑制,從而可以提供更多的基礎(chǔ)物質(zhì)來合成紫杉醇。Wang等對4種代謝抑制劑對紫杉醇合成前體IPP的研究顯示,美伐他汀、焦磷酸鈉(NaPP)、甘油醛抑制紫杉醇合成,而矮壯素(CCC)可提高紫杉醇產(chǎn)量,推測MVA途徑可能存在于紅豆杉細胞培養(yǎng)后期的IPP合成途徑中,并且部分IPP可能從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到了質(zhì)體中。劉智等通過定量PCR技術(shù)分別檢測兩條途徑的關(guān)鍵酶:3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(DXR)和5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(HMGR)的mRNA水平變化,發(fā)現(xiàn)磷甘霉素和洛伐它汀都能夠激活hmgr和dxr的轉(zhuǎn)錄,表明兩種合成IPP的代謝途徑之間存在協(xié)同作用,共同為紫杉醇的生物合成提供前體。同時發(fā)現(xiàn),在添加和未添加MeJA誘導(dǎo)的情況下,兩種途徑對紫杉醇的生物合成都具有貢獻,其中DXP途徑貢獻較大;Wang的研究也表明,在SA存在的條件下,被激活的DXP途徑是紫杉醇的前體IPP形成的主要原因。另外,一些糖醇也可作為誘導(dǎo)子,如甘露醇可不同程度地提高短葉紅豆杉和墨西哥紅豆杉離體細胞中紫杉醇含量。2.4紫杉醇的誘導(dǎo)表達大量研究表明,采用多因素協(xié)同誘導(dǎo)較單因素誘導(dǎo)更能提高紫杉醇產(chǎn)量。Luo等采用響應(yīng)面法(RSM)對細胞懸浮培養(yǎng)添加物進行了優(yōu)化,得到了中國紅豆杉細胞產(chǎn)紫杉醇最優(yōu)前體和誘導(dǎo)子添加條件:在培養(yǎng)的第12天添加10mg/LAgNO3、6mg/L脫落酸、23mg/L殼聚糖、15mg/LPhe、31mg/LMeJA、30mg/L苯甲酸鈉、30mg/L甘氨酸(Gly)以及在第16天添加20g/L蔗糖,紫杉醇產(chǎn)量可提高至54mg/L,是不優(yōu)化條件下的2倍。Toshio等以幾丁質(zhì)部分水解產(chǎn)物為誘導(dǎo)子,以GA3為植物生長調(diào)節(jié)劑,同時添加Phe為前體物質(zhì),結(jié)果顯示紫杉醇含量是添加幾丁庚糖的7倍。Sanro等向矮紫衫細胞懸浮培養(yǎng)基F4G4中添加前體Phe,再經(jīng)茉莉酸(JA)和幾丁庚糖協(xié)同誘導(dǎo),紫杉醇產(chǎn)量提高了4.1倍。另外,對待培養(yǎng)細胞進行同步化處理,同時采用誘導(dǎo)劑協(xié)同誘導(dǎo),也可提高細胞培養(yǎng)物中紫杉醇含量,李麗琴等將培養(yǎng)第8天的曼地亞紅豆杉進行4℃低溫同步化處理24h,同時添加MeJA協(xié)同誘導(dǎo),可使紫杉醇最終含量達54.7mg·L-1。3紫杉醇生物反應(yīng)器的研究與開發(fā)要實現(xiàn)紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇,生物反應(yīng)器培養(yǎng)是最好的實現(xiàn)途徑,而生物反應(yīng)器設(shè)計的核心技術(shù)在于先進的生物過程優(yōu)化和放大能力。由于在生物反應(yīng)器中所發(fā)生的反應(yīng)是在分子水平的遺傳特性、細胞水平的代謝調(diào)節(jié)和反應(yīng)器工程水平的混和傳遞等多尺度上發(fā)生的。如何利用生物反應(yīng)器中的多參數(shù)檢測技術(shù)和在線計算機控制與數(shù)據(jù)處理技術(shù),把細胞在反應(yīng)器中各種表型數(shù)據(jù)與代謝調(diào)控有關(guān)的基因結(jié)構(gòu)研究關(guān)聯(lián)起來,是反應(yīng)器過程優(yōu)化與放大的重要內(nèi)容,也是當(dāng)前國內(nèi)外競相發(fā)展的具有原創(chuàng)性的知識產(chǎn)權(quán)技術(shù)。韓榮斌采用Couette式剪切反應(yīng)器,考察了剪切力對不同生長期的對南方紅豆杉細胞的生物活性與次生代謝的影響,分析了剪切力與南方紅豆杉細胞防御應(yīng)答反應(yīng)之間的聯(lián)系。張長銀通過測定反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)過程懸浮液的表觀粘度,建立了反應(yīng)器中培養(yǎng)液表觀粘度與細胞濃度的線性關(guān)系式和單位細胞濃度培養(yǎng)液表觀粘度與細胞聚集體組成的線性關(guān)系式。這些研究成果為紫杉醇的生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)。目前用于紅豆杉大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器主要有機械攪拌式生物反應(yīng)器和以氣升式生物反應(yīng)器為代表的無攪動反應(yīng)器。程龍設(shè)計了一種耦合式生物反應(yīng)器:將兩個相同的通氣攪拌式生物反應(yīng)器通過0.22mm微孔膜進行分隔、耦合,組成一個能使全部物質(zhì)發(fā)生通透而不同細胞間不能互相接觸的耦合生物反應(yīng)系統(tǒng)。采用美麗鐮刀菌(