酶的定向進化

酶的定向進化技術一、定向進化的潛力

生物體系之所以能夠相對獨立地存在于自然界中，并維持其獨立性和生命的延續(xù)性，都是因為生物體內(nèi)的一系列酶在發(fā)揮著作用。酶保證了生物體內(nèi)組成生命活動的大量生化反應得以按照預定的方向有序、精確而順利地進行，幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶的作用緊密相關，可以這樣說，沒有酶的存在，就沒有生物體的一切生命活動。

天然酶的作用

利用酶作為催化劑進行生物催化與生物轉(zhuǎn)化，已成為生產(chǎn)精細化學品、手性藥物、食品添加劑等的重要工具,獲得了廣泛應用。

隨著酶催化應用范圍的不斷擴大和研究的逐步深入，研究者發(fā)現(xiàn)，酶催化的精確性和有效性常常不能很好地滿足酶學研究和工業(yè)化應用的要求，而且天然酶的穩(wěn)定性差、活性低使催化效率很低，還缺乏有商業(yè)價值的催化功能天然酶的局限

天然酶的局限性源于酶的自然進化過程?，F(xiàn)代生物工程的要求天然酶需各種生物分子之間協(xié)調(diào)，工業(yè)酶主要考慮活力與穩(wěn)定性，能具備長期穩(wěn)定性和活性天然酶作用環(huán)境與應用環(huán)境的差異，能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料

如何利用相對簡單的方法以達到對天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應用前景。二、酶的定向進化簡介易錯pcr、DNA改組、高突變菌株

1993年,美國科學家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進化的概念，并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶。蛋白質(zhì)定向進化概念的提出定向進化與自然進化比較自然進化非常緩慢，環(huán)境的多樣性和適應方式的多樣性決定了進化方向的多樣性。定向進化模仿自然進化的關鍵步驟：突變、重組、篩選酶分子研究認識與改造改造：合理設計（化學修飾、定點突變）非合理設計（定向進化、雜合進化）

人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外對基因進行隨機突變，從一個或多個已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個人工突變酶庫，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預先期望的具有某些特性的進化酶。定向進化技術理論上，蛋白質(zhì)分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件.所謂酶的體外定向進化（directedevolutionofenzymeinvitro）,又稱實驗分子進化（experimentallymolecularevolution）,屬于蛋白質(zhì)的非合理設計（irrationaldesign），它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制〔1〕，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進化機制（隨機突變、重組和自然選擇），在體外改造酶基因,并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶.酶的體外定向進化技術極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學的研究和應用范圍，特別是能夠解決合理設計所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領域逐漸顯示其生命力定向進化的原理定向進化＝隨機突變＋選擇隨機突變的策略易錯PCR技術(error-pronePCR)DNA改組(DNAshuflling)：由美國Stemmer于1994年首次提出一項體外重組技術隨機引發(fā)重組(RPR)1998年,Arnold提出了一種有效的新方法交錯延伸技術(StEP)：由Zhao等提出,是一種簡化的DNAshuffling技術易錯PCR易錯PCR（errorpronePCR）是指在擴增目的基因的同時引入堿基錯配，導致目的基因隨機突變。PCR:變性95、退火55、延伸酶的作用溫度72易錯PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調(diào)整反應條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運用低保真度DNA聚合酶等，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機突變體。在待進化酶基因的PCR擴增反應中，利用TaqDNA多聚酶不具有3′→5′校對功能的性質(zhì),配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫。連續(xù)易錯PCR連續(xù)易錯PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續(xù)反復地進行隨機誘變。注：易錯PCR突變率需仔細調(diào)控，不能高低，靶基因取代堿基1.5~5個，經(jīng)常一次突變很難獲得滿意的結(jié)果。將一次易錯PCR獲得的小突變累計產(chǎn)生重要的有益突變。Chen等人〔5，6〕用此策略使在非水相（二甲基甲酰銨,DMF）溶液中定向進化枯草桿菌蛋白酶E的活性獲得成功，所得突變體PC3在60%和85%的DMF中,催化效率kcat/Km分別是野生酶的256和131倍,比活性提高了157倍.將PC3再進行兩個循環(huán)的定向進化〔2〕,產(chǎn)生的突變體13M的kcat/Km比PC3高3倍(在60%DMF中),比野生酶高471倍.

在該方法中，遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部,故屬于無性進化（asexualevolution）.它較為費力、耗時，一般適用于較小的基因片段（<800bp）.此外,使用該方法易出現(xiàn)同型堿基轉(zhuǎn)換.其他無性進化化學誘導劑65度下直接用羥胺處理帶有目的基因片段的質(zhì)粒，內(nèi)切酶切下突變了的基因片段，再克隆表達致突變菌株注：遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部屬于無性進化DNA改組DNA改組(DNAshuffling)又稱有性PCR(sexualPCR)，原理如圖所示。注：切割成隨機片段，再進行不加引物的PCR循環(huán)，片段之間互為引物或模版，直到獲得全長的基因。該策略將親本基因群中優(yōu)勢突變盡可能結(jié)合在一起。DNA改組該策略的目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機會,導致更大的變異,最終獲取最佳突變組合的酶.在理論和實踐上,它都優(yōu)于“重復寡核苷酸引導的誘變”和“連續(xù)易錯PCR”.通過DNA改組,不僅可加速積累有益突變〔9〕,而且可使酶的2個或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體〔10～15〕.

外顯子改組外顯子改組(exonshuffling類似于DNA改組，與但與其不同，它是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上。注：改造幅度小但更實際外顯子改組（exonshuffling）〔16，17〕類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進行交換，前者尤其適用于真核生物.在自然界中,不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組,導致不同外顯子的結(jié)合,是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效途徑之一.與DNA改組不同,外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動,而DNA改組不受任何限制,發(fā)生在整個基因片段上.外顯子改組可用于獲得各種大小的隨機肽庫.雜合酶

雜合酶（hybridenzyme）〔18〕是把來自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元（二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、功能域）或整個酶分子進行組合或交換,以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的優(yōu)化酶雜合體.有許多途徑可以產(chǎn)生雜合酶，如定位誘變、DNA改組、不同分子間交換功能域，甚至整個分子融合.雜合酶可用于改變酶學或非酶學性質(zhì),是了解酶的結(jié)構(gòu)-功能關系、以及相關酶的結(jié)構(gòu)特征的有力工具，不僅如此，它還可以擴大天然酶的潛在應用，甚至可以產(chǎn)生催化自然界不存在的反應的新酶分子.雜合酶方法的有效性和實用性已得到了實驗的證實〔19～25〕體外隨機引發(fā)重組

體外隨機引發(fā)重組(randompriminginvitrorecombination,RPR)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的短DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應中，它們互為引物進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。

如果需要,可反復進行上述過程,直到獲得滿意的進化酶性質(zhì)

該法優(yōu)于DNA改組法的特點在于：（1）RPR可以利用單鏈DNA為模板,故可10～20倍地降低親本DNA量;（2）在DNA改組中,片段重新組裝前必須徹底除去DNaseⅠ,故RPR方法更簡單;（3）合成的隨機引物具有同樣長度,無順序傾向性.在理論上，PCR擴增時模板上每個堿基都應被復制或以相似的頻率發(fā)生突變;（4）隨機引發(fā)的DNA合成不受DNA模板長度的限制.交錯延伸

交錯延伸(staggerextensionprocess,StEP)在PCR反應中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,縮短其反應時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復進行，直到產(chǎn)生完整的基因長度。交錯延伸StEP法重組發(fā)生在單一試管中,不需分離親本DNA和產(chǎn)生的重組DNA.它采用的是變換模板機制,這正是逆轉(zhuǎn)錄病毒所采用的進化過程〔28〕.該法簡便且有效,為酶的體外定向進化提供了又一強有力的工具.酶法體外隨機-定位誘變

為解決空間結(jié)構(gòu)未知酶的蛋白質(zhì)工程問題,我們曾以類胰島素樣人參多肽基因和天冬氨酸酶基因為模型,探索了一種酶體外誘變的新途徑,即酶法體外隨機-定位誘變(random-site-

directedmutagenesis)〔29～32〕.該方法的內(nèi)涵與酶的體外定向進化類似,對目的基因既采用隨機突變增加突變位點,以快速產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)酶,又讓其突變受到一定限制,以減少篩選突變體的工作量.實際上,該法也是體外模擬自然進化.不同點在于，通過控制DNA合成的底物種類和濃度比例實現(xiàn)堿基對的錯配.

從上述策略不難看出,隨著分子生物學技術的發(fā)展,可以更靈活、快速和簡便地改造目的基因.從功能出發(fā),先獲得某優(yōu)化的突變體,一方面可快速將其推向應用,另一方面將對蛋白質(zhì)的理論研究起到更大的推動作用.定向進化的篩選策略瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過宿主菌的生長情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。微孔板懸浮法在含生色底物平板上培養(yǎng)，挑取具有活性的克隆接種到96孔板上檢測吸光度。使用微流控芯片。微球細胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個細胞附著在單個固體珠上，突變體進行分離和篩選。流式細胞計數(shù)法細胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細胞計數(shù)儀進行測定。突變體分離通過酶促反應的特征加入底物顯色熒光共振能量轉(zhuǎn)移同位素標記底物通過檢測底物消耗或產(chǎn)物生成進行終點檢測酶檢測信號探測分光光度計和熒光酶標儀氣相色譜和高效液相色譜質(zhì)譜和核磁通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關〔34，35〕.Venekei等人〔36〕報道了快速、有效地篩選蛋白水解酶突變體的方法和最佳篩選條件,主要是利用蛋白酶選擇平板初選,再配合活性染色（activitystaining）和X-光片消化分析（X-rayfilmdigestionassay）加以驗證,并檢測其活力,快速篩選了44000個突變株.

Roberts等人〔37〕用嗜菌體表面呈現(xiàn)技術篩選與嗜中性酯酶結(jié)合力更強的抑制劑.從含有4900個突變體的基因庫中，獲得與該酶的結(jié)合能力高于野生蛋白質(zhì)3.6×106倍的突變體,比已報道的任何一個相應的抑制劑高50倍〔38〕.

另有一些其他的篩選方法〔39，40〕,如加入能產(chǎn)生可見光信號的底物〔17〕或利用綠色熒光