結(jié)核分枝桿菌及其實驗室診斷新技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌

及其實驗室診斷新技術(shù)1精選課件結(jié)核病又稱為癆病和白色瘟疫。公元三世紀(jì)以前，我國古代醫(yī)學(xué)還只是認(rèn)識到該病可能是一種極為嚴(yán)重的慢性傳染病，“累年積月，漸就頓滯，以至于死，死后復(fù)轉(zhuǎn)旁人，乃至滅門”。以后逐漸認(rèn)識到這是一種“肺癆”，其病因為“癆蟲”所致。后來，西方的一些科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這類病人的肺內(nèi)有一個個堅實的團塊，摸上去像土豆或花生這類植物的根上塊莖，就將該病稱之為Tuberculosis，即結(jié)節(jié)的意思，這就是結(jié)核病命名的由來。結(jié)核病2精選課件《紅樓夢》：香魂一縷隨風(fēng)散，愁緒??三更入夢遙。雖然說《紅樓夢》與醫(yī)學(xué)無關(guān)，但其作者筆下的“癆病”代表林黛玉卻驚動全世界。上世紀(jì)50年代，美國細(xì)菌學(xué)家杜博斯所寫的《TheWhitePlague》(白色瘟疫)，就曾提到了林黛玉的肺結(jié)核，可見在當(dāng)時《紅樓夢》中林黛玉的病癥已是結(jié)核病的典型癥狀?！饵S帝內(nèi)經(jīng)素問》：“大骨枯稿，大肉陷下。胸中氣滿，喘息不便，內(nèi)痛引肩項，身熱，脫肉破腘?！苯Y(jié)核病3精選課件2011年全球結(jié)核病發(fā)病率（世界衛(wèi)生組織2012年結(jié)核病報告）結(jié)核病目前仍然是一個全球性的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病4精選課件流行過程傳染源

痰涂片陽性的肺結(jié)核病人傳播途徑空氣傳播易感人群普遍易感第二節(jié)流行病特征影響流行的因素自然因素季節(jié)、環(huán)境、居室通風(fēng)社會因素社會、經(jīng)濟、醫(yī)療服務(wù)其他因素HIV-TB，MDR/XDR-TB結(jié)核病5精選課件結(jié)核病防控的三大手段臨床診斷常常結(jié)合痰涂片，胸片，癥狀和體征結(jié)核病世界防治結(jié)核病日3月24日6精選課件結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的。。RobertKoch（1843-1910）1882年發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌，1905年獲得諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎。FriedrichNeelsen(1854-1898)FranzZiehl（1857-1926）

Ziehl-Neelsen染色法（分枝桿菌抗酸染色的基礎(chǔ)）結(jié)核分枝桿菌7精選課件結(jié)核分枝桿菌（一）生物學(xué)性狀1.形態(tài)與染色細(xì)長略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性8精選課件2.培養(yǎng)與生長特性特點專性需氧生長緩慢營養(yǎng)要求高，常用羅氏培養(yǎng)基生長現(xiàn)象液體：表面生長（菌膜）固體：顆粒、結(jié)節(jié)、花菜狀菌落乳白或米黃，不透明3.生化反應(yīng)不發(fā)酵糖類，觸酶試驗陽性，而熱觸酶試驗陰性結(jié)核分枝桿菌精選課件4.抵抗力四不怕干燥堿性染料青霉素等抗生素對酸或堿有抵抗力（3%HCl或6%H2SO4、4%NaOH）四怕乙醇濕熱紫外線抗癆藥物（異煙肼、利福平等）5.變異性形態(tài)結(jié)構(gòu)變異：

結(jié)核桿菌的L型：顆粒狀、絲狀毒力變異：

卡介苗BCG：Calmette和Guérin牛分枝桿菌13年230次耐藥性變異：耐異煙肼及其他抗結(jié)核藥物的結(jié)核菌株日益增多結(jié)核分枝桿菌10精選課件致病物質(zhì)（二）致病性莢膜與細(xì)胞表面受體結(jié)合（粘附與入侵作用）含多種酶（分解利用營養(yǎng)物質(zhì)）保護（阻止有害物質(zhì)的進入菌體）脂質(zhì)索狀因子（破壞細(xì)胞，引起肉芽腫）磷脂（形成結(jié)核結(jié)節(jié)）硫酸腦苷脂（抑制吞噬體與溶酶體結(jié)合）蠟質(zhì)D（引起遲發(fā)性過敏反應(yīng)）蛋白質(zhì)引起遲發(fā)性過敏反應(yīng)感染方式呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機體所致疾病結(jié)核病，以肺結(jié)核常見結(jié)核分枝桿菌11精選課件（三）免疫性1.機體抗結(jié)核免疫特點：傳染、免疫、超敏反應(yīng)共存2.屬于感染免疫(infectionimmunity)，又稱有菌免疫3.細(xì)胞免疫為主，遲發(fā)型超敏反應(yīng)同時存在4.郭霍現(xiàn)象:注射結(jié)核桿菌于豚鼠皮下初次注射局部反應(yīng)小全身擴散無免疫無超敏反應(yīng)再次注射局部反應(yīng)大不擴散有免疫有超敏反應(yīng)5.結(jié)核菌素試驗（OT試驗）：應(yīng)用結(jié)核菌素進行皮膚試驗來測定機體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)（Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)）的一種試驗結(jié)核分枝桿菌12精選課件

標(biāo)本處理：濃縮集菌（氫氧化鈉處理）直接鏡檢：抗酸染色分離培養(yǎng)：培養(yǎng)基、時間（2~4周后見結(jié)果）痰液等實驗室診斷新技術(shù)分離培養(yǎng)（一）傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查直接涂片13精選課件實驗室診斷新技術(shù)（二）TB-Beads技術(shù)LiuJ,SunZQ,PeiH,etal.Increasedcasefindingoftuberculosisfromsputumandsputumdepositsaftermagneticbeadconcentrationofmycobacteria.JMicrobiolMethods,

2013,93(2):144-147.14精選課件（三）核酸分子診斷技術(shù)-XpertMTB/RIF和TB-SAT靶基因菌種鑒定16SrRNAIS6110異煙肼katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh利福平rpoB乙胺丁醇embB吡嗪酰胺pncA鏈霉素rpsL、rrs喹諾酮類藥物gyrA、gyrB

ZhangY,etal.Nature,1992,358(6387):591-593.ScorpioA,ZhangY.NatMed,1996,2(6):662-667.實驗室診斷新技術(shù)15精選課件基因水平-PCR技術(shù)1.XpertMTB/RIFIndorsedbyWHOin2010.實驗室診斷新技術(shù)16精選課件2.TB-SAT技術(shù)SimultaneousAmplificationandTesting（RNA仁度）RNA作為臨床分子診斷靶標(biāo)的優(yōu)點RNA拷貝數(shù)≥DNA拷貝數(shù)更具臨床意義

生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍RNA遠不如DNA穩(wěn)定病原體死亡，RNA很快降解

1.交叉污染少

2.較好的愈后指標(biāo)實驗室診斷新技術(shù)17精選課件恒溫擴增-SAT技術(shù)TB-SAT技術(shù)原理實驗室診斷新技術(shù)18精選課件TB-RNA提取恒溫擴增實時檢測60°C10min42°C5min超聲儀（300W）15min痰液預(yù)處理42°C40min50ul稀釋液TB-SAT操作步驟實驗室診斷新技術(shù)19精選課件培養(yǎng)鑒定結(jié)果+PCR結(jié)果合計TB-SAT檢測結(jié)果陽性陰性陽性2317238陰性12318330合計243325568敏感度=231/243×100%=95.06%特異性=318/325×100%=97.85%準(zhǔn)確度=(231+318)/568×100%=96.65%恒溫擴增-SAT技術(shù)TB-SAT檢測的敏感度和特異性實驗室診斷新技術(shù)20精選課件（四）蛋白分子診斷技術(shù)-γ-干擾素釋放實驗結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細(xì)胞因子（IFN-γ）由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德國、法國、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中（IGRA，interferon-gammareleaseassay）實驗室診斷新技術(shù)21精選課件檢測過程與結(jié)果判斷陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照抗原A抗原B陽性對照（PHA）實驗室診斷新技術(shù)22精選課件美國FDA認(rèn)證臨床實驗數(shù)據(jù)經(jīng)培養(yǎng)確診的結(jié)核病患者樣本183例敏感度95.6%(175/183)306例入伍新兵特異性97.1%(297/306)T.SPOT.TB檢測的敏感度和特異性國內(nèi)臨床實驗數(shù)據(jù)T-SPOT.TB確診病例合計試驗組對照組陽性62430654陰性31478509合計6555081163靈敏度=95.3%；特異性=94.1%；準(zhǔn)確性=94.8%T.SPOT.T