實驗五 醋酸纖維薄膜電泳法分離牛血清蛋白

中國海洋大學實驗報告2013年11月09日姓名：郭沈杰年級專業(yè)：2012級生物科學同組者：蔡萍萍學號：12050011012實驗五醋酸纖維薄膜電泳法分離牛血清蛋白一、實驗目的掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離蛋白質(zhì)的原理和方法。二、實驗原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。當PH>PI時，蛋白質(zhì)為負離子，在電場中向陽極移動；當PH<PI時，蛋白質(zhì)為正離子，在電場中向陰極移動。血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)，它們所具有的可解離集團不同，在同一PH值時，因所帶電荷不同，而在電場中的移動速度也不相同，故可用電泳法將其分離。 本試驗以牛血清為材料，醋酸纖維薄膜為支持物，通過點樣、電泳、染色、脫色從而得到血清中蛋白質(zhì)的分離圖譜，再進行觀察和定量分析。 血清中含白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等。其等電點低于pH7.0，在緩沖液中（pH8.6）中，電離成負離子，在電場中向陽極移動。三、實驗儀器1、

牛血清 2、

醋酸纖維薄膜 3、

鑷子 4、

電泳儀 5、

電泳槽 6、

蓋玻片四、實驗試劑1、巴比妥—巴比妥鈉緩沖液（離子強度，PH8.6）：稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g，溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。用pH計較正后使用。2、

染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸餾水40ml混勻即可。3、

漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾水50ml混勻即可。五、實驗步驟1、準備：用鑷子取薄膜一條，浸入緩沖液中，完全浸透后（大約3-5分鐘），用鑷子取出，將無光澤的一面向上，平放在干凈濾紙上，將濾紙對折，吸取多余的緩沖液（注意不要吸的太干）。2、點樣：取蓋玻片一塊，用玻璃棒將血清均勻的涂在蓋玻片的一端面上，直直的在薄膜一端1/3處點樣。3、電泳：將薄膜平貼于放在電泳槽上并已浸透緩沖液的濾紙上，無光澤面要向下放置，點樣端放在陰極，進行電泳。電泳條件：電壓90-110V，電流0.4-0.6A,通電60分鐘。4、

染色：電泳完畢，將薄膜浸入染色液（回收）中10分鐘，進行染色。5、漂洗：染色完畢，將薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景無色，在浸入蒸餾水中。6、圖譜觀察：觀察圖譜，將各種血清蛋白質(zhì)按實際比例大小繪于實驗報告紙上。注意事項：1、醋酸纖維薄膜在光下面能明顯區(qū)分有光澤面和無光澤面；2、電泳槽中間為正極，兩端為負極；3、染色液用完后回收到原來的試劑瓶中；4、漂洗薄膜時，做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂幾次，既不浪費漂洗液，還達到了漂洗的效果。六、實驗結(jié)果電泳結(jié)果如下七、實驗分析1、醋酸纖維薄膜電泳法分離牛血清蛋白的原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。當PH>PI時，蛋白質(zhì)為負離子，在電場中向陽極移動；當PH<PI時，蛋白質(zhì)為正離子，在電場中向陰極移動。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、相對分子質(zhì)量、等電點及形狀的不同，在電場中的遷移速度不同，故可用電泳法將其分離。2、電泳注意事項：電泳時需要注意電流和電壓的控制，以及電泳時間。根據(jù)圖譜分析可以估算血清中蛋白質(zhì)的相對含量。圖譜中顏色的深淺和面積大小可以反應血清蛋白質(zhì)的含量，顏色較深者含量高，面積較大者含量高。由于電離時間等因素的影響，實驗存在一定的誤差。3、生物化學醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白的試驗中，如果區(qū)帶的分離效果不好，可能存在的影響因素：1.電泳時間不足2.薄膜在染色或漂洗時重疊緊密且時間很長3.薄膜在緩沖液中浸泡的時間不足4.點樣時薄膜上是否存在多余的水分...4、用醋酸纖維薄膜法可以將血清蛋白質(zhì)分為哪幾個區(qū)帶可分5條帶，分別為：α1—球蛋白、α2—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白、白蛋白?？赡芊肿恿吭叫。瑤щ娏吭礁?，運動速度越快。而這五種蛋白的分子量不同，帶電量也不同，在電泳時的速度有快有慢。八、思考題1、影響醋酸纖維薄膜電泳的因素有哪些，其是如何影響的？血清變質(zhì)：條帶數(shù)會有偏差。巴比妥溶液PH不合適：影響電泳速率。漂洗次數(shù)過多或時間過長：看不清楚條帶。點樣沒點好濃度不均或者條帶模糊。2、實驗過程中哪些操作會影響到實