不同生長時期微藻的動態(tài)積累過程

不同生長時期微藻的動態(tài)積累過程

0微藻生物柴油的生產(chǎn)隨著世界經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，石油、天然氣、天然氣等化石能源的消耗顯著增加。另一方面，石化能源正在惡化。另一方面，大量二氧化碳?xì)怏w進(jìn)入宇宙，導(dǎo)致溫室效應(yīng)。自《京都議定書》簽署生效后,二氧化碳在全球范圍內(nèi)受到排放限制,如何減排二氧化碳并對其進(jìn)行資源化利用也成為研究熱點。近年來生物柴油作為化石能源的替代燃料,已成為國際上發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的環(huán)?？稍偕茉?。生物柴油是指來自生物體的油脂(主要為甘油三酯)與醇類經(jīng)轉(zhuǎn)酯作用而形成的單烷基脂肪酸酯。歐美等國家耕地資源豐富,主要以油菜和大豆等植物油脂為原料;巴西主要利用蓖麻籽油進(jìn)行生物柴油生產(chǎn);日本利用煎炸廢油及牛油脂為原料生產(chǎn)生物柴油;東南亞國家種植油棕,獲取油脂資源。我國人口眾多,耕地資源匱乏,以油料作物為原料制備生物柴油不符合中國國情。我國的木本油料植物資源豐富,因此我國目前主要以木本油料植物為原料生產(chǎn)生物柴油,如麻瘋樹(Jatrophacurcas)、黃連木(Pistaciachinensis)、光皮樹(Cornuswilsoniana)等。但是這些木本油料植物的果實一般一年只收獲一次,以此為原料制備生物柴油受到季節(jié)的限制。微藻光合作用效率高,生長周期短、速度快。而且,微藻大多分布在江海湖泊中,不與農(nóng)作物爭地,可以整年生長。目前的產(chǎn)油藻主要是葡萄藻(Botryococcusbraunii)、小球藻(Chlorellapyrenoidosa)等。因此,微藻作為新型生物柴油原料,是未來生物柴油發(fā)展的研究熱點。微藻制備生物柴油存在兩個關(guān)鍵問題:一個是建立快速高效的產(chǎn)油藻篩選方法;一個是研究產(chǎn)油藻油脂積累的規(guī)律和機(jī)理,使收集時既滿足產(chǎn)油藻的高油脂含量,又滿足其高密度、高速率生長。為此我們利用尼羅紅染色法對微藻進(jìn)行篩選,并利用該方法對微藻中性脂的積累過程進(jìn)行了跟蹤,結(jié)合透射電鏡觀察脂肪體,使中性脂的積累過程更加形象、直觀。尼羅紅是一種具較強(qiáng)熒光特性的染料,它具有較強(qiáng)的疏水性,依溶劑疏水程度不同而呈現(xiàn)從金黃色到紅色不同的熒光顏色,但在水溶劑中,它的熒光完全淬滅。另外,尼羅紅具有光化學(xué)穩(wěn)定性,它特有的激發(fā)光波長范圍可以排除一些生物分子對測定的干擾。研究表明,尼羅紅染色后細(xì)胞熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)油脂含量顯著相關(guān)[9~15]。過去通常采用重量法和各類色譜法測定植物中的脂類含量[16~18]。這些方法不僅需要的生物樣品量大,而且需要一個較長的提取過程。尼羅紅染色法可以不經(jīng)抽提,直接測定藻類細(xì)胞的中性脂含量,而且所需生物樣品量小,使分析測定方法明顯簡化。1材料和方法1.1材料表面1.1.1板中培養(yǎng)板的培養(yǎng)63株海洋微藻取自寧波大學(xué)微藻種質(zhì)庫,使用NML3#培養(yǎng)液于24孔板中培養(yǎng)。每個孔加入1.5ml藻液和1mlNML3#培養(yǎng)液,溫度20℃,鹽度25~30‰,光照強(qiáng)度50μmol/(m2·s),光暗比12h∶12h,培養(yǎng)24h,活化藻種,使其均處于指數(shù)生長期。1.1.2熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡CASY快速細(xì)胞活力分析儀(CASYModelTT,Germany),酶標(biāo)儀(ThermoScientificVarioskanFlash),熒光顯微鏡(OlympusBX-60),透射電子顯微鏡(日立H-7650)。尼羅紅染液(0.5mg/mL)購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司,于-20℃保存,避免光照。1.2方法1.2.1藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度檢測藻種活化后,取96孔熒光板,每孔加入240μl活化藻液,1μl尼羅紅染液,振蕩混勻,30℃染色10min后,使用酶標(biāo)儀檢測530nm光激發(fā)下,580nm處的熒光強(qiáng)度,再扣除未染色藻液在該波長處的熒光強(qiáng)度。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。然后使用CASY快速細(xì)胞活力分析儀分別測定240μl藻液中藻細(xì)胞的總體積。每個樣品重復(fù)測定3次。以微藻單位體積內(nèi)的熒光強(qiáng)度表征微藻單位體積內(nèi)的中性脂含量。1.2.2中性脂質(zhì)體生物酶活性測定藻種篩選完成后,選取其中油脂含量較豐富的假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和綠色巴夫藻(Pavlovaviridis),在1.1.1所述相同條件下于100ml三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng),用于檢測中性脂的動態(tài)積累過程。蛋白核小球藻和綠色巴夫藻的接種密度約為2×106cells/mL,假微型海鏈藻的接種密度約為3×105cells/mL。從接種第二天開始,每天測定三種微藻的熒光強(qiáng)度和細(xì)胞密度,熒光強(qiáng)度測定方法同1.2.1藻種篩選,細(xì)胞密度的測定采用血球計數(shù)板法。以微藻單個細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度表征微藻單個細(xì)胞內(nèi)的中性脂含量。1.2.3熒光顯微鏡觀察取240μl的假微型海鏈藻藻液,加入1μl的尼羅紅染液,混合均勻,取一滴于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。另取假微型海鏈藻藻液,離心去上清,經(jīng)固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、定位、超薄切片和超薄切片染色后,使用透射電子顯微鏡觀察不同生長時期假微型海鏈藻細(xì)胞內(nèi)的脂肪體。2結(jié)果2.1小球藻熒光強(qiáng)度本實驗對寧波大學(xué)63株海洋微藻進(jìn)行了篩選,包括16株硅藻、16株綠藻、15株甲藻、12株金藻和4株黃藻(表1)。結(jié)果顯示,單位體積內(nèi)的熒光強(qiáng)度含量最高的為假微型海鏈藻,達(dá)到436.0,比常見的產(chǎn)油微藻———小球藻約高出1~3倍(被檢測的3株小球藻(NMBluh015-1、NMBluh015-2、NMBluh015-3)單位體積內(nèi)的熒光強(qiáng)度依次為257.0、117.6和122.0)。另外,不僅不同種微藻單位體積內(nèi)的熒光強(qiáng)度高低不同,同一種微藻的不同品系也有差別,比如Heterosigmaakashiwo的三個品系NMBRah03-2、NMBRah03-2-2和NMBRah03-2-3。篩選結(jié)果中,脂類含量高的前20株微藻中,硅藻6株,綠藻和金藻分別5株,甲藻和黃藻分別2株。2.2綠色巴夫藻的生長和接種過程實驗測定了假微型海鏈藻(T.pseudonama)、蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和綠色巴夫藻(P.viridis)三種海洋微藻的細(xì)胞密度和單個細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度在培養(yǎng)過程中的變化。如圖1所示,在培養(yǎng)的10d中,假微型海鏈藻單個細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度先減弱,再穩(wěn)定,第3d之后逐漸增強(qiáng);第3d假微型海鏈藻的生長進(jìn)入平臺期。這表明假微型海鏈藻單個細(xì)胞內(nèi)的中性脂在平臺期開始大量積累。在第1~2d熒光強(qiáng)度減弱,可能是因為假微型海鏈藻指數(shù)生長期和平臺期短暫,接種時已處于衰敗期,單個細(xì)胞內(nèi)的中性脂含量比較高。圖2中,蛋白核小球藻單個細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度在第1~3d增強(qiáng),第3~7d比較穩(wěn)定,第7d之后逐漸增強(qiáng);蛋白核小球藻第1~3d處于指數(shù)生長前期,第3~7d處于指數(shù)生長中期,第7d后進(jìn)入指數(shù)生長后期,最后到達(dá)平臺期。實驗表明蛋白核小球藻單個細(xì)胞內(nèi)的中性脂在指數(shù)生長前期有所增加,之后趨于穩(wěn)定,指數(shù)生長后期開始大量積累。圖3中,綠色巴夫藻單個細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度在前8d比較穩(wěn)定,第8d之后逐漸增強(qiáng);綠色巴夫藻第8d處于指數(shù)生長后期。表明綠色巴夫藻單個細(xì)胞內(nèi)的中性脂在指數(shù)生長后期開始大量積累。2.3透射電鏡觀察假微型海鏈藻在自然條件下為鏈狀分布,實驗室培養(yǎng)后分散成單個細(xì)胞,經(jīng)尼羅紅染色后,其脂肪體在熒光顯微鏡下發(fā)出黃色熒光,如圖4所示。由于假微型海鏈藻的個體很小,為了便于觀察,我們采用透射電鏡對脂肪體進(jìn)行進(jìn)一步的觀察。如圖5所示,A、B、C分別表示假微型海鏈藻在培養(yǎng)第2d、第5d、第8d時的透射電鏡圖,其中箭頭指示的為脂肪體。培養(yǎng)到第2d時只有一個脂肪體,第5d時有5個,第8d有6個。隨著培養(yǎng)時間的增加,脂肪體不僅數(shù)目增加,體積也變大。由圖1可知,第2d假微型海鏈藻生長比較旺盛,第5d達(dá)到平臺期末期,剛剛開始進(jìn)入衰敗期,第8d藻細(xì)胞已經(jīng)衰敗。培養(yǎng)到第8d時,從圖5C中我們看到藻細(xì)胞有了一系列衰敗跡象,細(xì)胞開始變形,片層結(jié)構(gòu)開始解體。3種微藻中性脂的積累Alonzo和Mayzaud于1999年利用尼羅紅染色法對浮游動物的中性脂和極性脂進(jìn)行熒光定量,發(fā)現(xiàn)用特定生物的脂類制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中熒光強(qiáng)度和脂類的濃度呈線性關(guān)系,當(dāng)用商業(yè)的脂類或者從其它生物獲得的脂類作標(biāo)準(zhǔn)曲線時誤差很大。因此,只有用特定生物的脂類制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,才能對特定生物不同生長時期的中性脂和極性脂進(jìn)行絕對定量。所以,對于不同藻種的篩選無法制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)曲線,本實驗得到的種質(zhì)庫藻種篩選結(jié)果只是對中性脂含量在不同微藻之間的相對篩選,對于其絕對含量需要通過重量法或者色譜法進(jìn)行進(jìn)一步測定。但是,尼羅紅染色法操作簡便,依然是一種很好的初級篩選方法。本研究篩選的結(jié)果表明,不僅不同種微藻的中性脂含量不同,同一種微藻不同品系的中性脂含量也有差別。硅藻、綠藻和金藻的中性脂含量比較高,含量最高的為假微型海鏈藻。尼羅紅染色法不僅可以用于篩選產(chǎn)油藻,而且也是跟蹤產(chǎn)油微藻的油脂積累過程的簡便方法。由圖1、圖2和圖3可知,三種海洋微藻單個細(xì)胞內(nèi)的中性脂均在平臺期或指數(shù)生長末期開始大量積累。這與魏東等對后棘藻(Ellipsoidionsp.)和眼點擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)的研究結(jié)果一致。Emdadi等、Dunstan等也報道指出,中性脂(主要是三酰甘油)在平臺期積累。雖然假微型海鏈藻的中性脂含量最高,但是其細(xì)胞密度在整個生長期都比較低?？赡苁桥囵B(yǎng)條件沒有達(dá)到假微型海鏈藻種群增殖的要求,如何提高假微型海鏈藻的細(xì)胞密度需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。從本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),即使同種不同品系的微藻單位生物量中性脂含量差異也很大,說明微藻中性脂的積累與種類、培養(yǎng)條件及生長時期都密切相關(guān)。提高微藻油脂含量的另一條途徑是通過基因工程方法對微藻進(jìn)行遺傳改造。美國再生能源國家實驗室(NationalRenewableEnergyLaboratory,NREL)于1991年開展了有關(guān)基因工程構(gòu)建高油微藻的工作,并于1995年將乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)基因轉(zhuǎn)化小環(huán)藻成功,這是一個重要突破。乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A,是脂肪酸合成過程中的限速酶。二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)是催化三酰甘油合成的最后一步反應(yīng)的酶,也是三酰甘油合成途徑的限速酶。這兩種酶在微藻不同培養(yǎng)條件和不同生長時期的表達(dá)差異是否與中性脂的積累相關(guān)值得