微藻生物柴油技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用

微藻生物柴油技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用

能源是可持續(xù)經(jīng)濟發(fā)展的動力，石化燃料資源的日益匱乏給全球經(jīng)濟發(fā)展帶來了危機?！吨袊茉窗l(fā)展報告(2011)》指出:“十一五”期間,中國能源消費總量達到32.5億t標(biāo)準(zhǔn)煤,年均增長6.6%,到2010年已成為世界第一大能源消費國。中國原油進口量從2005年的1.27億t增加到2010年的1.6億t,對外依存度接近55%。這給我國能源安全帶來了巨大的威脅,因此發(fā)展新型能源具有非常重要的意義。生物質(zhì)能源作為新型能源的典型代表已引起了越來越多科研人員的廣泛關(guān)注。作為生物質(zhì)能源,微藻被認為是一種極具潛力的生物柴油原料。微藻具有光合效率高,零凈碳值,細胞增殖快,生產(chǎn)周期短,所需的培養(yǎng)基來源豐富,所產(chǎn)的油脂成分與植物油類似,并且不與農(nóng)爭地、不與人爭糧、不影響全球能源分配等優(yōu)點。利用微藻生產(chǎn)生物柴油的工藝過程包括微藻的規(guī)模培養(yǎng)、細胞采收、油脂提取及生物柴油轉(zhuǎn)化等環(huán)節(jié)。其中微藻油脂的提取是影響微藻生物柴油技術(shù)產(chǎn)業(yè)化和生產(chǎn)成本的關(guān)鍵步驟之一。本文對近10年來微藻油脂制取過程中藻種的選擇、微藻細胞破壁方法以及微藻油脂提取技術(shù)方面的研究進展進行了綜述。1富油微藻細胞油脂含量高的優(yōu)良藻種是有效提取微藻油脂的前提。眾多科研人員研究發(fā)現(xiàn),油脂含量較高的微藻主要集中在綠藻、硅藻、金藻等真核微藻。常見的富油微藻主要有葡萄藻(綠藻)、小球藻(綠藻)、杜氏藻(綠藻)、三角褐指藻(硅藻)等。在某些情況下,尤其是逆境條件下(如氮短缺等),這些微藻細胞會大量積累油脂,主要是甘油三酯(葡萄藻則是積累烴類油脂)。常見富油微藻藻種的油脂含量如表1所示。2藻細胞油脂提取法由于微藻油脂大多存在于藻體細胞內(nèi),而且部分油脂以與蛋白質(zhì)或糖類結(jié)合的脂蛋白或脂多糖的形式存在,藻體細胞被較為堅韌的細胞壁所包裹,較難直接將油脂提取出來。因此,在油脂提取前需要對藻體進行破壁預(yù)處理。常見的預(yù)處理方法主要分為物理、化學(xué)和生物化學(xué)破壁法。2.1反復(fù)凍融法破碎細胞的研究微藻的物理破壁法主要包括高壓均質(zhì)法、研磨法、反復(fù)凍融法、超聲波破壁法、微波破壁法以及脈沖電場破壁法。高壓均質(zhì)是指微藻細胞在通過工作閥的過程中,在高壓下產(chǎn)生強烈的剪切、撞擊、空穴和湍流渦作用,從而使細胞得到破碎。在此過程中細胞的破碎程度與所用壓力、微藻細胞壁結(jié)構(gòu)以及細胞大小有關(guān)。Halim等在壓力為85MPa條件下對Chlorococcumsp.微藻進行高壓均質(zhì)破壁處理,細胞破碎率達到73.8%。采用高壓均質(zhì)具有破壁率高的特點,但所耗的能量較大,是一種能源密集型技術(shù)。研磨法是一種機械破壁方法,其原理是將微藻細胞與研磨劑(小珠)混合,通過高速研磨或攪拌,使微藻細胞與堅硬的研磨劑充分接觸,從而達到破壁的效果。Zheng等將Chlorellavulgaris微藻與0.4~0.6mm的玻璃珠研磨劑混合,在旋轉(zhuǎn)速度1500r/min的條件下破壁300min,Chlorellavulgaris微藻油脂的提取率達到10%,表明該法對微藻細胞有一定的破碎效果。Halim等在對微藻破壁方法的研究中發(fā)現(xiàn),采用研磨法可使Chlorococcumsp.微藻平均細胞破碎率達到17.5%。研磨法通常與有機溶劑提取法結(jié)合使用,當(dāng)微藻細胞濃度高且提取產(chǎn)物易于分離時,采用研磨法是一種經(jīng)濟有效的預(yù)處理手段。反復(fù)凍融法破碎細胞主要是利用細胞內(nèi)冰晶的形成和細胞液濃度增高引起溶脹。每次凍融在細胞內(nèi)外形成冰晶的部位不一樣,這樣就能對細胞不同部位的細胞壁和細胞膜產(chǎn)生破壞,因而多次凍融能使破碎效果提高。陳偉平等利用反復(fù)凍融法對紫球藻、薔薇藻和念珠藻3種藻細胞進行破碎,結(jié)果表明紫球藻和薔薇藻經(jīng)反復(fù)凍融細胞破碎率高。Soni等采用反復(fù)凍融法提取四點顫藻藻膽蛋白,研究表明4次凍融可以提取出胞內(nèi)大部分藻膽蛋白。王雪青等采用反復(fù)凍融法破碎17種微藻細胞,通過細胞破碎率檢測破碎效果,結(jié)果表明經(jīng)過2次凍融,10種微藻的破碎率在95%以上,4種在60%~80%,破碎效果與微藻細胞的種類、細胞壁組成等因素密切相關(guān)。反復(fù)凍融法具有方便、對熱敏性物質(zhì)沒有損害、不受外源性雜質(zhì)污染等優(yōu)勢,因而應(yīng)用廣泛。超聲波破壁法是一種適合大多數(shù)藻細胞的破壁方法,其原理是超聲波能夠?qū)γ劫|(zhì)產(chǎn)生獨特的機械振動作用和空化作用。當(dāng)超聲波振動時能產(chǎn)生并傳播強大的能量,在液體中還會發(fā)生空化作用使其在液體內(nèi)形成空化泡,若空化泡在微藻細胞壁附近破裂,就會破壞微藻細胞壁,使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。超聲波對細胞破碎的效率與細胞種類、時間、細胞濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。裴海燕等在研究藻細胞破碎對釋放有機物特性的研究中發(fā)現(xiàn),超聲處理確實增加了微藻細胞內(nèi)有機物的釋放。孫利芹等研究了超聲波對紫球藻的破碎效果,結(jié)果表明當(dāng)輸出功率150W、處理時間20min時,破碎率達到85%。王雪青等采用超聲波法破碎17種微藻細胞,細胞破碎結(jié)果顯示,經(jīng)過12min的超聲波處理,所有實驗藻種的破碎率均在90%以上。超聲波法具有破壁率高、處理時間短、對環(huán)境無污染等優(yōu)點,但目前超聲波處理對所提油脂品質(zhì)的影響還不很清楚且很難應(yīng)用到大規(guī)模生產(chǎn)中。微波破壁法的原理是微波加熱導(dǎo)致細胞內(nèi)的極性物質(zhì)尤其是水分子吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量,使胞內(nèi)溫度迅速上升,液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破,形成微小的孔洞;進一步加熱,導(dǎo)致細胞內(nèi)部和細胞壁水分減少,細胞收縮,表面出現(xiàn)裂紋。Lee等用微波法對微藻原料進行預(yù)處理后提取微藻中的油脂,研究表明微波法是一種簡單可行的預(yù)處理方法。Zheng等采用微波法對Chlorellavulgaris微藻進行破壁處理,研究表明微波破壁具有較好的破壁效果。微波破壁具有安全、快速等優(yōu)點,但由于微波法能使細胞內(nèi)產(chǎn)生大量熱量,因此采用微波預(yù)處理可能會對所提油脂的品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。脈沖電場破壁法是利用高壓脈沖電穿孔機理,在瞬間使細胞壁和細胞膜發(fā)生破壞。脈沖電場破壁法具有耗能少、處理時間短、不易引起蛋白質(zhì)和核酸變性等優(yōu)點,是一種新型的微藻破壁技術(shù)。目前,該技術(shù)運用于藻油提取的報道較少,但脈沖電場技術(shù)是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ奈⒃迤票诩夹g(shù)。2.2酶法細胞破碎法微藻的化學(xué)與生物化學(xué)破壁法主要包括酸熱法、化學(xué)滲透法、酶溶法等。酸熱法是將微藻細胞與酸加熱共煮一定時間,從而使細胞壁酸解破裂。Halim等在對微藻破壁方法的研究中發(fā)現(xiàn),將Chlorococcumsp.微藻與8%的硫酸在160℃條件下共煮45min,可使微藻細胞的破壁率達到33.2%。化學(xué)滲透法則是使用有機溶劑或無機溶液來改變細胞壁的通透性,達到破壁效果。此法較為溫和,但操作時間較長。陳偉平等利用低濃度氯化鈣溶液對紫球藻、薔薇藻和念珠藻3種藻細胞進行破碎,研究表明低濃度氯化鈣對3種微藻都有一定的破壁效果,其中對念珠藻的破壁效果最明顯。酶溶法通過各種水解酶將細胞壁分解,酶法細胞破碎技術(shù)不僅能提高胞內(nèi)產(chǎn)物的提取效率、降低能耗,還能減少化學(xué)試劑的用量,有利于環(huán)保。何擴等在小球藻破壁技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn),纖維素酶單獨作用的最佳酶量為2%,復(fù)合酶作用的最佳酶量為1%。姜劍鋒等對寇氏隱甲藻進行破壁研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶法破壁后能夠提高微藻油脂的提取率,把酶法破壁和超聲波法破壁結(jié)合起來,破壁率可高達91.7%。Zheng等采用酶解法對Chlorellavulgaris微藻進行破壁處理,發(fā)現(xiàn)酶解法的破壁效果明顯優(yōu)于研磨法等機械破壁方法。采用化學(xué)與生物化學(xué)破壁法具有破壁率高、能耗低等優(yōu)點,但由于化學(xué)與生物化學(xué)破壁法需要引入化學(xué)試劑或酶制劑,在一定程度上會增加后期生產(chǎn)過程中產(chǎn)物分離與提純的困難。3微藻細胞內(nèi)的油脂的提取微藻細胞采用某些破壁方法預(yù)處理后,大部分油脂仍貯留在細胞內(nèi),需采用合適的方法將微藻細胞內(nèi)的油脂進一步提取出來。目前常用的微藻油脂提取方法主要有:有機溶劑提取法、超臨界萃取法、亞臨界溶劑法以及耦合提取技術(shù)等。3.1微藻油脂的提取有機溶劑提取法是目前國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的微藻油脂提取技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用固液萃取的原理,選用某種能夠溶解油脂的有機溶劑,經(jīng)過對微藻的接觸(包括浸泡或噴淋等)使微藻油脂溶解在選定的溶劑中而被萃取出來。對選用的有機溶劑通常有以下幾個要求:對油脂有較好溶解度、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、容易與油脂分離、安全性能好。實驗室常用的提取溶劑主要有石油醚、正己烷、丙酮、氯仿、乙醇和甲醇等,也可利用混合溶劑提取微藻油脂。Ranjan等采用索氏提取法和Bligh-Dyer法提取微藻油脂,得出的結(jié)論是微藻油脂提取的機制是細胞擴散,并且發(fā)現(xiàn)溶劑的選擇是影響微藻細胞中油脂擴散的主要因素。劉群等以石油醚/乙醚為溶劑提取球等鞭金藻海藻油,通過單因素實驗和正交實驗確定最佳提取工藝,得到的油脂提取率約為40.8%。劉圣臣等以小球藻為原料,采用乙醇作為溶劑提取海藻油,在最佳工藝條件下出油率達到24.28%。Hemanathan等利用正己烷提取海洋微藻中的油脂,油脂提取率為(45±4)%。日本電力工業(yè)中央研究院(CRIEPI)于2010年宣布了一種采用液化二甲醚在常溫下有效提取海藻油的方法。該方法利用液化二甲醚能夠與水和油混合的獨特性,在室溫下對海藻同時進行脫水和提油。與傳統(tǒng)方式相比,不僅可減少脫水和干燥需要的能量,還可以減少所需的有機溶劑用量。此外,微藻油脂的提取還可采用直接皂化法和直接酯化法。直接皂化法即原料直接與醇堿溶液(KOH-CH3OH或KOH-C2H5OH)反應(yīng)提取,該方法提取快速、簡便,但脂肪酸的提取率比較低;直接酯化法是指原料與酯化試劑(乙酰氯或三氟化硼的醇溶液)進行酯交換,提取率較高,但酯化試劑通常毒性較大。采用有機溶劑法提取微藻中的油脂具有出油率高、容易實現(xiàn)大規(guī)模和自動化生產(chǎn)等優(yōu)點,但由于有機溶劑通常具有揮發(fā)性和毒性,不利于人體健康和環(huán)保。因此,如何在微藻油脂提取過程中減少有機溶劑的使用已成為近年來的研究熱點。3.2超臨界流體萃取超臨界萃取技術(shù)是近二三十年發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù),在超臨界狀態(tài)下,利用超臨界流體具有的優(yōu)良溶解性及這種溶解性隨溫度和壓力變化而變化的原理,將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸,使其選擇性地把不同極性大小、沸點高低和相對分子質(zhì)量大小的成分依次萃取出來,借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體,被萃取物質(zhì)則完全或基本析出,從而達到分離提純的目的。超臨界流體萃取過程是由萃取和分離兩個過程組合而成的,一般用CO2作為萃取劑萃取油脂。超臨界萃取的效果與壓力、萃取溫度、CO2流速以及萃取時間有關(guān)。程霜等確定了螺旋藻油超臨界CO2萃取的最佳工藝條件:萃取壓力25MPa,萃取溫度40℃,萃取時間2h,在此條件下螺旋藻油的萃取率為95.3%。Andrich等研究了超臨界萃取微綠球藻的動力學(xué)過程,在萃取條件55MPa,萃取溫度40℃條件下,油脂提取率約為250mg/g。在超臨界萃取過程中,加入少量乙醇作輔助溶劑,可以提高CO2的溶解度,降低萃取所需的溫度與壓力,達到更好的萃取效果。Mendes等用乙醇作輔助溶劑,采用超臨界萃取法提取Arthrospira微藻中的油脂,發(fā)現(xiàn)油脂提取率與Bligh-Dyer法相當(dāng)。超臨界萃取法具有操作溫度低、提油率高、環(huán)境污染小等優(yōu)點,但是所需設(shè)備昂貴、提油過程耗能大、對操作條件要求高。3.3在微擬生物原料的萃取中的應(yīng)用亞臨界溶劑提取技術(shù)是一種新的加速萃取技術(shù),其原理是將樣品置于密閉容器中加溫加壓,通過升高壓力提高溶劑的沸點,使溶劑在高于正常沸點的溫度下仍處于液態(tài),加速被提取物從原料顆?；|(zhì)中解析并快速進入溶劑。Young等利用離子液體萃取酵母和小球藻等生物原料的油脂,在離子液體中添加甲醇、乙酸、丙酮、氯仿等溶劑,使原來的萃取體系成為共溶劑體系,油脂萃取效率得到了顯著提高。李植峰等在真菌油脂提取實驗中發(fā)現(xiàn),在氯仿、甲醇有機溶劑萃取的基礎(chǔ)上加入酸,能大大縮短樣品的處理時間,且油脂提取率優(yōu)于超臨界CO2萃取法。陳閩等用不同亞臨界溶劑從微擬球藻濕藻泥中提取油脂,結(jié)果表明亞臨界乙醇-正己烷溶劑對濕藻細胞有較高的油脂萃取率且消耗的溶劑少,若加入少量硫酸可進一步提高油脂的提取率,降低溶劑用量。由此可見,亞臨界溶劑法提取微藻中的油脂具有速度快、所耗有機溶劑少、提油率高等優(yōu)點。3.4聯(lián)合法提取微藻油耦合法提取微藻油脂主要包括:超聲輔助提取法、微波輔助提取法、脈沖電場輔助提取法以及酶提取法等微藻油脂提取技術(shù)。3.4.1利用科技強化提取超聲輔助提取法是指利用超聲波的熱效應(yīng)、機械效應(yīng)和空化效應(yīng),強化溶劑提取過程,達到縮短提取時間,減少溶劑用量,提高油脂提取率的目的,是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ睦猛饬鰪娀崛〉男录夹g(shù)。盧群等采用超聲輔助提取小球藻(Chlorellasp.)中的油脂,結(jié)果表明利用超聲波強化溶劑提取過程可縮短提取時間、提高溶劑利用率、減少溶劑用量、提高提油率。Cravotto等采用超聲輔助溶劑法提取Crypthecodiniumcohnii微藻中的油脂,可以將油脂提取率從4.8%(索氏抽提法)提高到25.9%。3.4.2脂提取率的提取微波輔助提取法是指利用微波的熱效應(yīng),在對微藻細胞進行破壁的同時,強化有機溶劑提取過程,達到縮短提取時間,減少溶劑用量,提高油脂提取率的目的。Cravotto等采用微波輔助法提取Crypthecodiniumcohnii微藻中的油脂,可以將油脂提取率從4.8%(索氏抽提法)提高到17.8%。Balasubramanian等采用微波輔助法提取Scenedesmusobliquus微藻中的油脂,提取率從47%(索氏抽提法)提高至77%,提取時間從10h縮短至20min,且提取的油脂質(zhì)量較好。3.4.3微藻油脂的提取高壓脈沖電場是一種新型的非熱加工技術(shù),利用高壓脈沖電穿孔機理可以實現(xiàn)細胞膜的穿孔作用,對于提取細胞內(nèi)的成分具有很好的作用效果。目前已經(jīng)有不少報道將該技術(shù)應(yīng)用于玉米油、大豆油、橄欖油等植物油的提取過程中,是一種具