微藻中高度不飽和脂肪酸含量的研究進(jìn)展

微藻中高度不飽和脂肪酸含量的研究進(jìn)展

高度飽和脂肪酸（pma）在營養(yǎng)和醫(yī)學(xué)中的重要作用引起了人們的廣泛關(guān)注。特別是20碳5烯酸（epa）和22碳6烯酸（dap）對預(yù)防和治療心臟疾病、冠狀動脈粥樣硬化、癌癥、風(fēng)病、哮喘和糖尿病等人類疾病方面發(fā)揮了明顯作用。在水產(chǎn)上,EPA和DHA是許多魚類幼體、對蝦幼體、雙殼類幼蟲的必需脂肪酸,關(guān)系到幼蟲和幼體的生長發(fā)育和存活。EPA和DHA雖然對有些動物不是必需的,但在餌料中適當(dāng)添加這些物質(zhì),可提高投喂動物的生長速度和存活率。目前國內(nèi)外對微藻中的EPA和DHA已進(jìn)行了大量研究,取得了不少成就。1微藻脂肪酸的測定國外早在五十年代就已對微藻的脂肪酸含量進(jìn)行研究,到目前為止,已測定了上百個品種微藻的脂肪酸。它們隸屬硅藻類、金藻類、綠藻類、甲藻類、紅藻類、隱藻類、藍(lán)藻類、黃藻類。其中研究最多的是三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、小球藻(Chlorellaspp.)、鹽藻(Dunaliellasp.)、微綠球藻(Nannochloropsisoculata)等。其中EPA含量高的有Amphiprorahyalina,Nitzschiaclosterium,Thalsssionemapseudonana,Phaeodactylumtricornutum,Chlorellaminutissima,Nannochloropsisoculata,Porphyridiumcruentum等。DHA含量高的有Cylindrothecafusiformis,Isochrysisgalbana,Pavlovalutheri,Peridinopsisborgei,Gymondinumsp.,Peridiniumcinctum,Peridiniumcinctum等。Kayama等對七十年代中期以前所測微藻的脂肪酸含量進(jìn)行了總結(jié)?，F(xiàn)將七十年代中期之后所測微藻的EPA和DHA含量總結(jié)如下(表1)。2藻類和繁殖條件對微藻epa和沉積物含量的影響2.1epa和1.4培養(yǎng)物的遺傳多樣性國外早在五十年代就已進(jìn)行微藻脂肪酸組成的分析,結(jié)果表明:不僅不同種類的微藻EPA和DHA含量差別很大,即使同一種類的不同品系之間也存在很大差別。Alonso等對分離出的Isochrysisgalbana的59個品系的EPA和DHA含量進(jìn)行了測定,結(jié)果表明,不同品系EPA和DHA含量差別很大,EPA占總脂的百分比為13.19%～31.93%,平均為23.00%,占總干重的百分比為1.81%～6.61%,平均為4.23%,DHA占總脂的百分比為4.25%～13.36%,占總干重的百分比為0.58%～2.77%,EPA和DHA含量的差異可能是由于不同品系之間遺傳差異引起的。Alonso等選擇一株富含EPA的Isochrysisgalbana進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果表明,原始培養(yǎng)物中,EPA占總干重的2.4%,第一代分離出來的培養(yǎng)物的EPA占總干重的6.6%,第二代占總干重的7.8%。每一代有明顯增長。同樣,DHA占總干重的百分比也從原始培養(yǎng)物的0.9%上升到第二代的3.8%。而同時,Isochrysisgalbana其它品系的第二代培養(yǎng)物EPA和DHA含量的差別有明顯下降,這表明,選擇EPA和DHA高含量的微藻品系是完全可行的。2.2溫度對nitzshiapera含量的影響大量的實驗結(jié)果表明,溫度對EPA和DHA含量有顯著的影響,Teshima等對海洋小球藻(Chlorellasp.)的研究結(jié)果表明,當(dāng)鹽度為25,溫度14.0～24.7℃時,EPA含量(占總脂肪酸的百分比,以下同)從28.2%上升到38.4%,隨溫度的升高而升高,但當(dāng)溫度為24.7～28.5℃時,EPA含量則從38.4%下降到16.0%。Renand等進(jìn)行的實驗表明,溫度為10～25℃時,Nitzschiapaleacea的EPA含量從28.4%下降到18.1%,隨溫度的升高而下降;同樣,DHA含量(占總脂肪酸的百分比,以下同)也從1.2%下降到0.6%。溫度為20～30℃時,Nitzschiaclosterium的EPA含量從8.3%下降到6.5%,DHA含量從0.4%下降到0.1%。Seto等的實驗結(jié)果表明,當(dāng)溫度為20℃時,Chlorellaminutissima的EPA含量為44.7%,而當(dāng)溫度升到25℃時,這種藻的EPA含量則下降到20.3%。周洪琪等發(fā)現(xiàn),溫度為15～30℃時,Isochrysissp.(Tahitian)的EPA含量受溫度的影響不大,DHA含量隨溫度的升高而下降,當(dāng)溫度為15°C時,Isochrysissp.(Tahitian)的DHA含量最高,為11.4%。溫度對有些藻類影響不大,如Cholrellavulgaris,其脂肪和脂肪酸在不同溫度下變化不大,只是在低溫時,碳水化合物較高。因此溫度與微藻EPA和DHA含量的變化并非都是一致的,可能與微藻的生態(tài)類型有關(guān)。2.3nacl濃度對epa含量的影響鹽度能改變微藻中脂肪酸的組成,但作用結(jié)果因種而異。Cohen和Heimer對Porphyridiumcruentum的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)NaCl濃度從0.25M增加到2.0M時,EPA含量從37.5%下將到18.9%。Yongmanitchai和Ward對Phaeodactylumtricornutum的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)NaCl濃度在0～5g·L-1時,EPA含量變化不大,在39.0%～37.6%之間;但當(dāng)NaCl濃度大于5g·L-1時,EPA含量迅速下降,當(dāng)NaCl濃度為24g·L-1時,EPA含量僅為24.3%。Teshima等對海洋小球藻(Chlorellasp.)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度為14.5℃、鹽度為4～30時,EPA含量在29.4%～33.3%之間變化,變化不明顯,表明小球藻在較低的鹽度下也能合成較多的EPA。2.4pavlovaluheni水氣溶膠凝劑pfds光照對EPA和DHA含量的影響十分顯著。大多數(shù)藻類其EPA含量隨光強(qiáng)的增加而減少,其中包括Nannochloropsissp.;Nannochloropsisoculata;Chaetocerossimplex等。例如當(dāng)光子流密度(PFDS)從225μE·m-2·s-1下降到6μE·m-2·s-1時,Chaetocerossimplex的EPA含量從6.1%上升到15.5%。而藻類中的DHA含量則一般隨光強(qiáng)的增加而增加。例如當(dāng)光子流密度從225μE·m-2·s-1下降到6μE·m-2·s-1時,Pavlovalutheri的DHA含量從9.7%下降到3.6%。但并非所有的藻類都有這種趨勢,光照對Chlorellaminutissima的總脂含量和脂肪酸組成影響不大,EPA含量隨光照的增強(qiáng)而略有上升(從39.1%到43.5%)。光照對可異養(yǎng)或混養(yǎng)的藻類EPA含量的影響較大。Day和Tsavalos對Tetraselmissp.進(jìn)行的實驗表明,在有光照的條件下,EPA占總脂的5.31%,而在黑暗的條件下僅占0.73%。2.5氮源和濃度對epa含量的影響培養(yǎng)液化學(xué)組成的變化包括氮、磷、維生素和微量元素的含量、氮與磷的比例、是否添加HUFA前體、是否添加葡萄糖、果糖、蔗糖、酵母浸膏、乙酸、乙醇等作為碳源和能源,以上這些因素都可影響EPA和DHA含量。培養(yǎng)液中氮的種類和濃度都能明顯影響微藻中EPA和DHA含量。Yongmanitchai和Ward對Phaeodactylumtricornutum的研究發(fā)現(xiàn),不同氮源對EPA含量有明顯影響,分別使用硝酸鈉、氯化銨、尿素作為氮源時,EPA含量分別為25.2%、10.1%和31.8%?？梢钥闯?用硝酸鹽和尿素作為氮源時,EPA含量較高,而用銨鹽作為氮源時,EPA含量較低。但分別用硝酸鹽和銨鹽作為氮源培養(yǎng)Nannochloropsisoculata時,則發(fā)現(xiàn)用銨鹽作為氮源,EPA含量為17.8%,比用硝酸鹽作為氮源時EPA含量(13.0%)高。氮的濃度對EPA含量也有影響。當(dāng)?shù)獫舛容^低時,EPA含量隨氮濃度的升高而升高,而當(dāng)?shù)獫舛冗_(dá)到一定水平后,EPA含量則隨氮濃度的升高而下降。當(dāng)硝酸鈉的濃度在0.25～1.50g·L-1時,EPA含量從9.1%上升到32.1%,隨硝酸鈉濃度的增加而增加,而當(dāng)硝酸鈉濃度超過1.50g·L-1時,EPA含量和生物量都下降。磷對EPA含量的影響也很顯著。培養(yǎng)Phaeodactylumtricornutum時發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)液中磷酸鹽(K2HPO4)濃度從0.05g·L-1增加到0.5g·L-1時,EPA含量從20.1%上升到28.4%。2.6molratchol-m-2s-1240ld不同發(fā)育時期的脂肪酸含量微藻細(xì)胞在不同生長時期有不同的生化組成。Brown等對Thalassiosirapseudonana的研究表明,當(dāng)光照為50μmolphone·m-2·s-1(24∶0L∶D)時,在指數(shù)生長期收獲和靜止期收獲對EPA和DHA含量影響不明顯。而當(dāng)光照為100μmolphone·m-2·s-1(24∶0L∶D)時,收獲期對EPA和DHA含量影響都比較明顯,EPA占干重的百分比從指數(shù)生長期的24.3%下降到靜止期的16.2%,而DHA占干重的百分比則從指數(shù)生長期的4.7%下降到靜止期的3.0%。Fernandez-Reiriz等對七種微藻分別在指數(shù)生長期、靜止期早期、靜止期晚期進(jìn)行收獲,測定脂肪酸含量。結(jié)果表明:PhaeodactylumtricornutumEPA含量在上述三個時期分別是6.3%、14.9%和9.1%,DHA含量分別是0.61%、1.1%和0.4%。EPA和DHA含量都是在靜止期早期達(dá)到最大。而Isochrysisgalbana的EPA含量和DHA含量則在靜止期晚期達(dá)到最大,Rhodomonassp.的EPA和DHA含量則在指數(shù)生長期達(dá)到最大。說明收獲期對EPA和DHA影響較大,而且影響程度因種而異。2.7出比自養(yǎng)條件下更多的epaTan和Johns對九種海水硅藻進(jìn)行篩選,只有一種能在異養(yǎng)條件下產(chǎn)出比自養(yǎng)條件下更多的EPA,即Nitzschialaevis。在異養(yǎng)條件下EPA含量為23.2%,而自養(yǎng)條件下為16.7%,這表明,可在培養(yǎng)基中添加葡萄糖作為碳源和能源異養(yǎng)培養(yǎng)此種藻,來生產(chǎn)EPA。2.8下貯藏方法對epa和酶含量的影響Grima等對Isochrysisgalbana進(jìn)行冷凍干燥、冷凍(不加防凍劑)、冷凍(加防凍劑)、4℃下冷藏四種不同的方法進(jìn)行保存,結(jié)果表明,不同的保存方法對EPA和DHA含量影響不明顯,保存一個月后,EPA和DHA含量均有所下降。Ahlgren等對Chlamydomonassp.,Chlorellasp.,Rhodomonassp.三種藻類進(jìn)行了冷凍干燥處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷凍干燥處理對EPA和DHA含量影響不明顯。2.9porphirus聯(lián)合產(chǎn)物的誘導(dǎo)與誘導(dǎo)效果通過誘變可提高EPA含量。Alonso等以PhaeodactylumtricornutumBohlinUTEX#640為親本用紫外線對其進(jìn)行了誘變,結(jié)果第一代EPA含量比親本提高了37%,第二代EPA含量比親本提高了44%。當(dāng)在1L的細(xì)口瓶中進(jìn)行培養(yǎng)時,親本、第一代、第二代EPA分別占干重的1.73%、3.15%和3.86%。EPA產(chǎn)量分別為3.48mg·L-1·d-1、4.01mg·L-1·d-1和4.98mg·L-1·d-1。Cohen和Heimer用除草劑(SAN9785)對Porphyridiumcruentum進(jìn)行誘變,使EPA含量從親本的29.1%提高到誘變種的45.4%。實驗結(jié)果表明,通過誘變來篩選EPA含量高的藻種,是很有發(fā)展前途的。3藻細(xì)胞中表達(dá)epa和酶目前市場上的EPA和DHA產(chǎn)品主要從深海魚油中提取,而魚類對EPA和DHA的合成能力很弱,主要從食物中攝取,其產(chǎn)量僅能滿足世界需求量的60%。微藻是主要的初級生產(chǎn)力,許多種類的微藻能自身合成EPA和DHA,其相對含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于魚油中的[6,8,10,11,12,15,16,21,24]。從藻細(xì)胞中提取的EPA和DHA產(chǎn)品沒有腥臭味,不含膽固醇。某些藻類分別具有較豐富的EPA或DHA,例如Isochrysisgalbana(Tahitian)EPA含量很低(0.2%～0.9%),而DHA的含量很高(15.4%～19.4%)。NannochloropsisoculataEPA含量很高(17.8%～39.9%),而DHA含量很低(<0.1%)。這樣就減少了EPA和DHA提取過程中的相互干擾。有些藻類可以直接食用,避免了提純過程中的氧化分解。由于許多藻類可進(jìn)行大規(guī)模的人工培養(yǎng),產(chǎn)量高,周期短。因此,利用微藻生產(chǎn)EPA和DHA是很有前途的。培養(yǎng)微藻生產(chǎn)EPA、DHA的研究始于80年代初期,培養(yǎng)的形式主要有三種。3.1化碳供給不足開放式大池培養(yǎng)是既傳統(tǒng)又簡單的微藻培養(yǎng)系統(tǒng),但開放式大池培養(yǎng)系統(tǒng)中存在著二氧化碳供給不足、難以控溫、水份蒸發(fā)嚴(yán)重、易污染及生產(chǎn)不穩(wěn)定等問題。據(jù)Cohen和Heimer報道,大池培養(yǎng)的PorphyridiumcruentumEPA產(chǎn)量冬天為0.5mg·L-1·d-1,夏天為1.0mg·L-1·d-1。3.2光生物反應(yīng)器信息化反應(yīng)培養(yǎng)國外光生物反應(yīng)器的研究工作,自80年代以來,發(fā)展迅速,已設(shè)計的用于微藻培養(yǎng)的光生物反應(yīng)器有各種形式和特點(diǎn)。密閉式光生物反應(yīng)器主要有以下幾種形式:管道式光生物反應(yīng)器、平板式光生物反應(yīng)器、光纖光生物反應(yīng)器等各種光生物反應(yīng)器,其主要特點(diǎn)為:最大的表面積與體積比、最有效的光源系統(tǒng)、光能傳遞到微藻的最短光路、最有效的混合循環(huán)等,因此,可取得高密度、高產(chǎn)、高效培養(yǎng)。Burgess等用光纖生物反應(yīng)器培養(yǎng)Isochrysisgalbana(Tahitian),DHA的最大產(chǎn)量為4.3mg·L-1·d-1。Grima等用管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)IsochrysisgalbanaALII-4,EPA的最大產(chǎn)量為8.2mg·L-1·d-1。Molina等用管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)PhaeodactylumtricornutumUTEX640,EPA的最大產(chǎn)量為13mg·L-1·d-1。Sanchez-Perez等用恒化器培養(yǎng)Isochrysisgalbana,EPA的最大產(chǎn)量為7.2mg·L-1·d-1,DHA的最大產(chǎn)量為3.1mg·L-1·d-1。但利用封閉式光生物反應(yīng)器進(jìn)行微藻自養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)EPA、DHA存在著以下問題:(1)培養(yǎng)后期,由于細(xì)胞密度升高,降低了光照強(qiáng)度,大部分細(xì)胞處于“黑暗”之中。(2)反應(yīng)器內(nèi)壁易發(fā)生附壁現(xiàn)象。(3)反應(yīng)器內(nèi)易積累氧氣,降低不飽和脂肪酸的含量。3.3藻種的選擇和生產(chǎn)設(shè)備異養(yǎng)培養(yǎng)是以可利用有機(jī)碳(葡萄糖、醋酸鹽等)作為唯一碳源和能源進(jìn)行微藻培養(yǎng),異養(yǎng)培養(yǎng)可解決封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)微藻存在的問題,具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)易進(jìn)行高密度的純種培養(yǎng),(2)可實現(xiàn)培養(yǎng)條件的自動控制。由于異養(yǎng)培養(yǎng)具有上述優(yōu)點(diǎn),近幾年開展了大量的研究工作,Gladue對可異養(yǎng)培養(yǎng)微藻進(jìn)行了很好的總結(jié),除此之外,還有以下種屬可進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng):硅藻類:Naviculaincera,Naviculapelliculosa,Nitzschialaevis。綠藻類:Chlamydomonashumicola,Chlamydomonasreinhardtii,Chlorellaautotrophica(Clone580),Chlorellasaccharophila,Chlorellasorokiniana,Tetraselmis,TetraselmisCSL161,Ulvalactuca。藍(lán)藻類:Anabaenavariabilis,Fremyelladi