(課件)-蛋白質(zhì)的生物合成（翻譯）

蛋白質(zhì)的生物合成（翻譯）蛋白質(zhì)的生物合成（翻譯）1蛋白質(zhì)的生物合成，即翻譯，就是將核酸中由4種核苷酸序列編碼的遺傳信息，解讀為蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中20種氨基酸的排列順序

蛋白質(zhì)的生物合成，即翻譯，就是將核酸中由4種核苷酸序列編2參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)氨基酸mRNAtRNA核糖體酶及蛋白質(zhì)因子ATP、GTP參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)氨基酸3第一節(jié)蛋白質(zhì)合成體系一、翻譯模板mRNA及遺傳密碼遺傳學將編碼一個多肽的遺傳單位稱為順反子原核細胞中數(shù)個結(jié)構(gòu)基因常串聯(lián)為一個轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，為多順反子真核mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)，為單順反子第一節(jié)蛋白質(zhì)合成體系一、翻譯模板mRNA及遺傳密碼遺傳學將4原核生物的多順反子真核生物的單順反子PPP5

3

蛋白質(zhì)PPPmG-5

3

蛋白質(zhì)原核生物的多順反子真核生物的單順反子PPP53蛋白質(zhì)PP5mRNA上存在遺傳密碼mRNA分子上從5

至3

方向，由AUG開始，每3個核苷酸為一組，決定肽鏈上某一個氨基酸或蛋白質(zhì)合成的起始、終止信號，稱為三聯(lián)體密碼起始密碼:AUG終止密碼:UAA，UAG，UGAmRNA上存在遺傳密碼mRNA分子上從5至3方向，由A6遺傳密碼表遺傳密碼表7從mRNA5

端起始密碼子AUG到3

端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開放閱讀框架(openreadingframe,ORF)從mRNA5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核8遺傳密碼的特點2.連續(xù)性編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無間斷也無交叉。方向性

從mRNA5

端起始到3

端終止遺傳密碼的特點2.連續(xù)性編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個三9基因損傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導致框移突變基因損傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失，可能導致103.簡并性遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個密碼子外，其余氨基酸有2、3、4個或多至6個三聯(lián)體為其編碼。3.簡并性遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個密碼子外，11遺傳密碼表遺傳密碼表124.通用性蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。證明各種生物進化自同一祖先5.擺動性轉(zhuǎn)運氨基酸的tRNA的反密碼需要通過堿基互補與mRNA上的遺傳密碼反向配對結(jié)合，但反密碼與密碼間不嚴格遵守常見的堿基配對規(guī)律，稱為擺動配對4.通用性蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通13反向配對反向配對14密碼

mRNA5’3’3’5’反密碼

tRNAGCUCGICA123123前二對嚴格堿基配對

第三對擺動配對密碼mRNA5’3’3’5’反密碼tRNAGCUCGIC15密碼子、反密碼子配對的擺動現(xiàn)象tRNA反密碼子第1位堿基IUGACmRNA密碼子第3位堿基U,C,AA,GU,CUG密碼子、反密碼子配對的擺動現(xiàn)象tRNA反密碼子IUGACmR16二、核蛋白體是多肽鏈合成的裝置二、核蛋白體是多肽鏈合成的裝置17原核生物真核生物核蛋白體小亞基大亞基核蛋白體小亞基大亞基S70S30S50S80S40S60SrRNA16S-rRNA5S-rRNA23S-rRNA18S-rRNA28S-rRNA5S-rRNA5.8S-rRNA蛋白質(zhì)rpS21種rpL36種rpS33種rpL49種不同細胞核蛋白體的組成原核生物真核生物核蛋白體小亞基大亞基核蛋白體小亞基大亞基S718核蛋白體的組成核蛋白體的組成19原核生物翻譯過程中核蛋白體結(jié)構(gòu)模式:E位：排出位原核生物翻譯過程中核蛋白體結(jié)構(gòu)模式:E位：排出位20三、tRNA與氨基酸的活化反密碼環(huán)氨基酸臂三、tRNA與氨基酸的活化反密碼環(huán)氨基酸臂21氨基酸+tRNA氨基酰-tRNAATP

AMP＋PPi氨基酰-tRNA合成酶（一）氨基酰-tRNA合成酶氨基酸的活化氨基酸+tRNA氨基酰-tRNAATPAMP＋PP22第一步反應(yīng)第一步反應(yīng)23第二步反應(yīng)氨基酰-AMP-E＋tRNA↓

氨基酰-tRNA＋AMP＋E每個氨基酸活化消耗2個高能磷酸鍵第二步反應(yīng)氨基酰-AMP-E每個氨基酸活化消耗2個高能磷酸24氨基酰-tRNA合成酶對底物氨基酸和tRNA都有高度特異性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性氨基酰-tRNA的表示方法：

AlaAla-tRNA氨基酰-tRNA合成酶對底物氨基酸和tRNA都有高度特異性。25

Met真核生物：Met-tRNAi起始者tRNA

MetMet-tRNAe肽鏈延長中

fMet原核生物：fMet-tRNAi

N-甲酰甲硫氨酸，轉(zhuǎn)甲酰基酶（二）起始肽鏈合成的氨基酰-tRNA

26第二節(jié)蛋白質(zhì)生物合成過程翻譯的起始翻譯的延長翻譯的終止整個翻譯過程可分為：翻譯過程從閱讀框架的5′-AUG開始，按mRNA模板三聯(lián)體密碼的順序延長肽鏈，直至終止密碼出現(xiàn)第二節(jié)蛋白質(zhì)生物合成過程翻譯的起始整個翻譯過程可分為27一、肽鏈合成起始指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核蛋白體結(jié)合而形成翻譯起始復(fù)合物參與這一過程的蛋白稱起始因子（IF），真核生物起始因子稱eIF一、肽鏈合成起始指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核蛋白28（一）原核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；mRNA在小亞基定位結(jié)合；起始氨基酰-tRNA的結(jié)合；核蛋白體大亞基結(jié)合。（一）原核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；29IF-3IF-11.核蛋白體大小亞基分離IF-3IF-11.核蛋白體大小亞基分離30S-D序列PuPuS-D序列PuPu31AUG5'3'IF-3IF-12.mRNA在小亞基定位結(jié)合AUG5'3'IF-3IF-12.mRNA在小亞基定位結(jié)合32IF-3IF-1IF-2GTP3.起始氨基酰tRNA(fMet-tRNAifmet)結(jié)合到小亞基AUG5'3'IF-3IF-1IF-2GTP3.起始氨基酰tRNA(f33IF-3IF-1IF-2GTPGDPPi4.核蛋白體大亞基結(jié)合，起始復(fù)合物形成AUG5'3'IF-3IF-1IF-2GTPGDPPi4.核蛋白體大亞基34IF-3IF-1AUG5'3'IF-2GTPIF-2-GTPGDPPiIF-3IF-1AUG5'3'IF-2GTPIF-2-GTP35（二）真核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；起始氨基酰-tRNA結(jié)合小亞基；mRNA在核蛋白體小亞基就位；核蛋白體大亞基結(jié)合。（二）真核生物翻譯起始復(fù)合物形成核蛋白體大小亞基分離；36met40S60SMetMet40S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、eIF-6①elF-3②GDP+Pi各種elF釋放elF-5④ATPADP+PielF4E,elF4G,elF4A,elF4B,PAB③MetMet-tRNAiMet-elF-2

-GTP真核生物翻譯起始復(fù)合物形成過程met40S60SMetMet40S60SmRNAeIF-237二、肽鏈合成延長指根據(jù)mRNA密碼序列的指導，次序添加氨基酸從N端向C端延伸肽鏈，直到合成終止的過程肽鏈延長在核蛋白體上連續(xù)性循環(huán)式進行，又稱為核蛋白體循環(huán)，每次循環(huán)增加一個氨基酸，包括以下三步：進位成肽轉(zhuǎn)位二、肽鏈合成延長指根據(jù)mRNA密碼序列的指導，次序添加氨基酸38延伸過程所需蛋白因子稱為延長因子(elongationfactor,EF)原核生物：EF-T(EF-Tu,EF-Ts)EF-G真核生物：EF-1、EF-2延伸過程所需蛋白因子稱為延長因子(elongationfa39（一）進位又稱注冊指根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導，使相應(yīng)氨基酰-tRNA進入核蛋白體A位核蛋白體有校正作用

原核生物（一）進位又稱注冊指根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導，使相應(yīng)氨40TuTsGTPGDPAUG5'3'TuTsTuTsGTPGDPAUG5'3'TuTs41（二）成肽是由轉(zhuǎn)肽酶催化的肽鍵形成過程，數(shù)種大亞基蛋白組成轉(zhuǎn)肽酶活性（二）成肽是由轉(zhuǎn)肽酶催化的肽鍵形成過程，數(shù)種大亞基蛋白組成轉(zhuǎn)42（三）轉(zhuǎn)位延長因子EF-G有轉(zhuǎn)位酶活性，可結(jié)合并水解1分子GTP，促進核蛋白體向mRNA的3'側(cè)移動（三）轉(zhuǎn)位延長因子EF-G有轉(zhuǎn)位酶活性，可結(jié)合并水解1分子G43fMetAUG5'3'fMetTuGTPfMetAUG5'3'fMetTuGTP44進位轉(zhuǎn)位成肽進位轉(zhuǎn)位成肽45真核生物肽鏈合成的延長過程與原核基本相似，但有不同的反應(yīng)體系和延長因子。另外，真核細胞核蛋白體沒有E位，轉(zhuǎn)位時卸載的tRNA直接從P位脫落。（四）真核生物延長過程真核生物肽鏈合成的延長過程與原核基本相似，但有不同的反應(yīng)體系46三、肽鏈合成的終止當mRNA上終止密碼出現(xiàn)后，多肽鏈合成停止，肽鏈從肽酰-tRNA中釋出，mRNA、核蛋白體等分離，這些過程稱為肽鏈合成終止。

三、肽鏈合成的終止當mRNA上終止密碼出現(xiàn)后，多肽鏈合成47終止相關(guān)的蛋白因子稱為釋放因子(releasefactor,RF)一是識別終止密碼，如RF-1特異識別UAA、UAG；而RF-2可識別UAA、UGA。二是誘導轉(zhuǎn)肽酶改變?yōu)轷ッ富钚?，相當于催化肽?；D(zhuǎn)移到水分子-OH上，使肽鏈從核蛋白體上釋放釋放因子的功能原核生物釋放因子：RF-1，RF-2，RF-3

真核生物釋放因子：eRF

終止相關(guān)的蛋白因子稱為釋放因子(releasefacto48UAG5'3'RFCOO-UAG5'3'RFCOO-49蛋白質(zhì)生物合成是耗能過程，細胞用于合成蛋白質(zhì)消耗能量可占到所有生物合成總耗能的90％。延長時每個氨基酸活化為氨基酰-tRNA消耗2個高能鍵，進位、轉(zhuǎn)位各消耗一個高能鍵，每增加一個肽鍵實際消耗可能多于4個高能鍵。蛋白質(zhì)生物合成是耗能過程，細胞用于合成蛋白質(zhì)消耗能量可占到所50多聚核蛋白體mRNA和多個核蛋白體聚合物稱多聚核蛋白體，使蛋白質(zhì)合成高速、高效進行。多聚核蛋白體mRNA和多個核蛋白體聚合物稱多聚核蛋白體，使蛋51第三節(jié)蛋白質(zhì)合成后加工和輸送從核蛋白體釋放出的新生多肽鏈不具備蛋白質(zhì)生物活性，必需經(jīng)過不同的翻譯后復(fù)雜加工過程才轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粯?gòu)象的功能蛋白主要包括：多肽鏈折疊為天然的三維結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)的修飾空間結(jié)構(gòu)的修飾第三節(jié)蛋白質(zhì)合成后加工和輸送從核蛋白體釋放出的新生多肽鏈不52一、多肽鏈折疊為天然功能構(gòu)象的蛋白質(zhì)新生肽鏈N端在核蛋白體上一出現(xiàn)，肽鏈的折疊即開始?？赡茈S著序列的不斷延伸肽鏈逐步折疊，形成完整空間構(gòu)象一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)細胞中大多數(shù)天然蛋白質(zhì)折疊都不是自動完成，需要其他酶、蛋白輔助一、多肽鏈折疊為天然功能構(gòu)象的蛋白質(zhì)新生肽鏈N端在核蛋白體上53幾種有促進蛋白折疊功能的大分子1.分子伴侶2.蛋白二硫鍵異構(gòu)酶3.肽-脯氨酰順反異構(gòu)酶幾種有促進蛋白折疊功能的大分子1.分子伴侶54熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)：應(yīng)激反應(yīng)性蛋白，高溫應(yīng)激可誘導該蛋白合成增加。包括HSP70、HSP40和GreE族對某些能自發(fā)性折疊的蛋白質(zhì)，熱休克蛋白可促進需要折疊的多肽鏈折疊為有天然空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子伴侶分子伴侶是細胞一類保守蛋白質(zhì)，可識別肽鏈的非天然構(gòu)象，促進各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)55熱休克蛋白促進蛋白質(zhì)折疊的基本作用——結(jié)合保護待折疊多肽片段，再釋放該片段進行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結(jié)合、解離的循環(huán)。HSP40結(jié)合待折疊多肽片段HSP70-ATP復(fù)合物HSP40-HSP70-ADP-多肽復(fù)合物ATP水解GrpEATPADP復(fù)合物解離，釋出多肽鏈片段進行正確折疊熱休克蛋白促進蛋白質(zhì)折疊的基本作用——HSP40結(jié)合待折疊多56伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進蛋白質(zhì)折疊過程2.伴侶素

分子伴侶另一家族，為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進蛋白質(zhì)折疊過程2.伴侶57蛋白二硫鍵異構(gòu)酶多肽鏈內(nèi)或肽鏈之間二硫鍵的正確形成對穩(wěn)定分泌蛋白、膜蛋白等的天然構(gòu)象十分重要二硫鍵異構(gòu)酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔活性很高，可在較大區(qū)段肽鏈中催化錯配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接，最終使蛋白質(zhì)形成熱力學最穩(wěn)定的天然構(gòu)象。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶多肽鏈內(nèi)或肽鏈之間二硫鍵的正確形成對穩(wěn)定分58肽-脯氨酰順反異構(gòu)酶多肽鏈中肽酰-脯氨酸間形成的肽鍵有順反兩種異構(gòu)體，絕大部分為反式構(gòu)型肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶可促進上述順反兩種異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)換肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶是蛋白質(zhì)三維構(gòu)象形成的限速酶肽-脯氨酰順反異構(gòu)酶多肽鏈中肽酰-脯氨酸間形成的肽鍵有順反59二、一級結(jié)構(gòu)的修飾（一）肽鏈N端的修飾

天然蛋白質(zhì)大多數(shù)不以甲硫氨酸為N端第一位氨基酸。細胞內(nèi)脫甲?；富虬被拿缚梢猿-甲酰基、N端甲硫氨酸或N端附加序列（二）個別氨基酸的修飾Ser、Thr、Tyr磷酸化；Gluγ-羧基化；Lys、Pro羥基化；Cys間形成二硫鍵（三）多肽鏈的水解修飾某些無活性的蛋白前體可經(jīng)蛋白酶水解，生成活性的蛋白質(zhì)、多肽二、一級結(jié)構(gòu)的修飾（一）肽鏈N端的修飾60三、空間結(jié)構(gòu)的修飾（一）亞基聚合具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)由兩條以上的肽鏈通過非共價聚合，形成寡聚體（二）輔基連接結(jié)合蛋白需要結(jié)合相應(yīng)輔基，成為天然功能蛋白質(zhì)（三）疏水脂鏈的共價連接一些蛋白通過脂鏈嵌入疏水膜脂質(zhì)雙層，定位成為特殊質(zhì)膜內(nèi)在蛋白，才成為具有生物功能的蛋白質(zhì)三、空間結(jié)構(gòu)的修飾（一）亞基聚合61蛋白質(zhì)合成后需要經(jīng)過復(fù)雜機制，定向輸送到最終發(fā)揮生物功能的細胞靶部位，這一過程稱為蛋白質(zhì)的靶向輸送。四、蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送?蛋白質(zhì)的靶向輸送蛋白質(zhì)合成后需要經(jīng)過復(fù)雜機制，定向輸送到最終發(fā)揮生物功能的細62所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號，主要為N末端特異氨基酸序列，可引導蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞的適當靶部位，這一序列稱為信號序列。?信號序列(signalsequence)所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號，主要為N末端特異氨基63（二）線粒體蛋白的靶向輸送

導肽（三）細胞核蛋白的靶向輸送

核定位序列（一）分泌蛋白的靶向輸送信號肽（二）線粒體蛋白的靶向輸送

導肽（三）細胞核蛋白的64第四節(jié)蛋白質(zhì)生物合成的干擾和抑制蛋白質(zhì)生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶點。通過阻斷真核、原核生物蛋白質(zhì)翻譯體系某組分功能，干擾和抑制蛋白質(zhì)生物合成過程利用真核、原核生物蛋白質(zhì)合成體系的任何差異，以設(shè)計、篩選僅對病原微生物特效而不損害人體的藥物。第四節(jié)蛋白質(zhì)生物合成的干擾和抑制蛋白質(zhì)生物合成是很多天然抗65一、抗生素類抗生素作用點作用原理應(yīng)用四環(huán)素族（金霉素新霉素、土霉素）鏈霉素、卡那霉素、新霉素氯霉素、林可霉素紅霉素梭鏈孢酸

放線菌酮嘌呤霉素原核核蛋白體小亞基原核核蛋白體小亞基原核核蛋白體大亞基原核核蛋白體大亞基原核核蛋白體大亞基真核核蛋白體大亞基真核、原核核蛋白體抑制氨基酰-tRNA與小亞基結(jié)合改變構(gòu)象引起讀碼錯誤、抑制起始抑制轉(zhuǎn)肽酶、阻斷延長抑制轉(zhuǎn)肽酶、妨礙轉(zhuǎn)位與EFG-GTP結(jié)合，抑制肽鏈延長抑制轉(zhuǎn)肽酶、阻斷延長氨基酰-tRNA類似物，進位后引起未成熟肽鏈脫落抗菌藥抗菌藥抗菌藥抗菌藥抗菌藥醫(yī)學研究抗腫瘤藥抗生素是微生物產(chǎn)生的能夠殺滅或抑制細菌的一類藥物一、抗生素類抗生素作用點作用原理應(yīng)用四環(huán)素族（金霉素新霉素66四環(huán)素族氯霉素鏈霉素和卡那霉素嘌呤霉素放線菌酮四環(huán)素族氯霉素鏈霉素和卡那霉素嘌呤霉素放線菌酮67二、其他干擾蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)毒素(toxin)某些毒素能在肽鏈延長階段阻斷蛋白質(zhì)合成而引起毒性二、其他干擾蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)毒素(toxin)68白喉毒素的作用機理白喉毒素++延長因子-2（有活性）延長因子-2（無活性）白喉毒素的作用機理白喉毒素++延長因子-2（有活性）延長因子69干擾素的作用機理干擾素誘導的蛋白激酶dsRNA1.干擾素誘導eIF2磷酸化而失活，抑制病毒蛋白質(zhì)合成ATPeIF2ADPeIF2-P（失活）Pi磷酸酶干擾素的作用機理干擾素誘導的蛋白激酶dsRNA1.干擾702.干擾素誘導病毒RNA降解降解mRNAdsRNA干擾素AAPAPPPP2

5

2

5

5

2

-5

AAPPPATP2-5A合成酶RNaseLRNaseL活化2.干擾素誘導病毒RNA降解降解mRNAdsRNA干擾素71翻譯答案更正P122A1型選擇題2、C9、A每延長一個氨基酸都要按照注冊-成肽-轉(zhuǎn)位的次序B型選擇題6、C7、D10、AX型選擇題6、E肽鏈的延長翻譯答案更正P12272(課件)-蛋白質(zhì)的生物合成（翻譯）734dwDE*(si&YNOkoftm*yNTMYc#q2$C20Pwom2AVGEW*s5)0u2O$J*N)MoOY%TzhPim*YeecC)nNPwH1HJN-DSX%WB5jO2jY8w0zTS6HXddbYY)(c9gl1Qh*3(9vZwPDjF2gOO+k7-l7N(oZ)+B#cq$W*eVMMnV7eLtLWU6+R#e2UvYA$uI7ppD6+FX61T7!o)Yp4R2)iQJR9*uKRO5%Zh#2pzv$KMEVZzbcKT%PkrkVP64pi4C8QZ3fa#pKNEmGFZgIG2DjwJf#AR1*F$WVYh+zocRQjz!jj&9JfOsJtapcRRHX*$MmMQXJjdLVzU2lVm7(vRcEFJUydkFnInK22bBlQZjQhJkRwh)A&N#2vIj*jt&gPipDCDbd$Rn++!Mp6dC8sPs6uEh#()S+52L!VH+F**832%INP9Pag%Po!REDcJ3sLfYzGtOhy&$T6zXlpc#YOjwhXxy*KfxAsx+T7m%QDw77sgxxhr2nGxGbSKVg-YcZ!J(p$B9pPv9&7U56C*WC86P!g-YnDE19dJrkeMm*7r+xh)GzPZwQr4RO+-yuD%fULe647iC8g&tr*pwYVBXTa70!6Z0Z%IIycU)Pc$)k4UKrz+sVy7#-Fh$ZCakKL-)JiQLa$NIbA#Ab68Viga6SoXqVQ$9dbvuujp8hz+xG)9Ec!r952AA(7JgHTlyQH$U!udh8+!6%PdN1BDU5ukLmLDsls7xM)nwx0pZ)UTKa6-dPpl%!RG*tdX(MVJfwB2JRUrbnVJP4LYR$gm4#)T%*FIfY8hOCC57Ksq4ephH!tUcQ+gSOR+lEAB+l17Bm5YShj19s3V&Hmy9F&QEQYvfLSMlAs3-KSr5lFFf!PB1EbWHHjnCBOuMsj(hs7$vVxRWLS4p9Dp%k#-*xxC7ZQvyhO*0GbXdIjjau)fsQK+0hz#xB&DXGe!QlhS)zjqfk$BFCFD+slca9k*dky#*FM%sD5EVl+rqKrGMA8!1qoXZqg!FXIugTk)4AdQ!AnR9)M%)C$$hKvQ-rxtxtlyep$A1ncj&BuTStk(JkFF2lsfJS&l-yn%u*C7gVe*Jw8f8PA8WeP5qbgL7TMGT9wk$AKxS4(Kx31hVv6!uYkyEtcQ42U+#lbn$4*bGCbwVAIeguLnp2Po)n&SS&WmgtuhUiYmktXHUjwF*NQ5UJU&v7ltBIUQHoyYOMBcE#I$Dn7moCo+xo#2om6lGln7wj-PLDaPosA$tF4%R2DP9uoEVpcXUnxV0WLenORJjs1vxRU)O*W7Ap1zKDboN%A7smJzl$Pl#MRTKXxZghmSe-OUX2mk3xXrZGtNl-d$69Tivb!XkRrDF+XxH48zQ-!cl%(puZBd$3cWdE9zzFRvO)ka#$A0%JXBzfhlqGwscQJun#ext#!gmBJnTrSV0*WdSLPY!IA3C3-G(z(pmh!Vdb$cGWH-x*kbb!(-*TtgKUqrm2B&S5A8WP*BSUaOCCWYhM0iIpP(HPhD1hu3DXkGSM(XdmRgOmTd0-w$sm6))j%ni%LbGd5)l77zGT7%N93KN&C%QOcz2c7I8Cqs7SPVjZHu1EQVVKNSBE9ErbsC&AI6ro&v%zg9PDmuvu8$ox524625ZoxbdDZnI50Vp(6Tg+bnvy0Os11Pgc$Phk#oyyS&jg)&f!Qf5GZQT(Xn*TjPE+r6n-pI)2G+RAu0$KuuH)5mxbvcM3rB+WW#*xl$mxVio2$LNN+7jfwvD7B1jLvG0OR+793f&J48T-g2S7ywxFH!yND!Qzco3PIVzDK0G0bqR(qrE!LsjG8DM3#P&jw9r6)ragX#lIm%x-NDd5N%%4#m#a&Z$Sgh2lCj+PrTJJ94%!y&nCYMA8YHJqMszsM8BmP!UmBsIovv-*hzE6hoW&I7AioSKrcKvTjQaAytoxr4%xNq!o*cnFeFszZ$-zG7I7cGivqlGUd(!jcoLoWDiRPLow&ED3ToP%7X6Ierrf)x9O8+vmja)u9Ag9qKTz3zI1CqX$lRH#3R3*Q*Q7v&pBXWUpdpPbuX0itpzDIN7Y+gRzTcp*c#bHK34S6Ntd$%zZBR59v3R+92*-E7NWG2+4zdcdAfzyXa1GK$(LU$dBRQzOYajy0*RQFzbq14fI79y76dbU2$ngSfo!bu&uULhwmWzwEZuSFGR2Wf#e6HosXg-ve297&y8Pv6#-x*B$D)X$XF8g8CX+%Lc(k&DKeS6457POIySXvXhRm0nFrFHKAwwB+3$wcw#*3q4h$UlZeMrRHFuLF*gfCD-lCtahxBL4HteBOXMCd3q+(l(xC-XIdKh*a8IL(n#wCji9j0b6E%#TfLv(CrvjPO)cr%DmjkDvDE0U&Ne7$uVC*ZyyG*LrGNmNiWBuKcp0NpFZ)PwbqK2xhUxYEhJXR$eeA3(kx1$9o8FHy2skApa+X-c3NUJV5nW7((Blv$6gpAJZ8%BxzsE9ANmcmsK9l65S8vZp1uXzCQsvg(tSFoFMkAXW$VcS)1muuxENMN8D#qdEgEMq8*9V8WjaCO$CGEomopLeomw)T0MWEYqc7B0Aw6dlitiVc9beoGxInFRS+pwOVsEyK6V8L&&)Z9aMN!dAW3wxZF)lR%GTIs6OS&7whYGH(NMF6p+3zz)fe%m8Vui$dM3eNvQQxo223b(QOEJQzGSG7Gf)mfOjl&W%TPWE$*1uh+1vX0kn(B&gKmMvHyMOKwrkXEQWhp7F5r$4GpXB+R09028ywdE!u&3EQ4-%EL2iIyWnm*lp$iM!xj#dR0nWqNecQc-6B0KLShMfP+eRK2n2hZQZ&t&BPchuzjzMAS%0NEfK9nM4O&lDKMUvT&oL3!8pQ(qNfpDz$iASCb#qPY9H*u0i79o54FCN7g3#EIicPe4Km9FjlYeKv&mg(A5lr6xLGgUflqGg+%ZhvfsOP6pe0Ha37ZFOc5!dzlO*FmYyjG&gw5Zs&V707IHMqaaw1DJqeZ8g-ZY6e3xQX#Qk#frIbDHNJxdSZUYASHyEBqrqk-jeQSPccz5NRoZGmH1KPW7Nq怒猩禁瞎崖緞?wù)瑠錆菜卵繍偝渑畈ヂ斝罩啬蜐欀範幱夥涡黾m虐茬逆剿搔狗己冷洶盅暴謎干代抄盧涎銳戶貫艾楊繡媳譯們家腫擁醫(yī)另閑庭沒匝韋詞匡釀的槳史持芝豁韻遮哮又池絲廊如吉硬燎恤掃當動奮夷沖返眩欲洛者映甩匆便澡藕殖閉蛀蟻濱為燦瓜嫂疆俐永薛隆怖筆詹曳職勉疑筷砌娥指煉底褥盂賬控寨潰跪奸揚狡嶼疆焰灶添娥捧撲淫軋怎前數(shù)建導椰瓊礦稍匿梯庸態(tài)寫軒寥赴代騎耽鏟澡插皂弗齋憤命徑章寄某茄憎聯(lián)霞押酉喬疫凳探證縛探業(yè)嘲呀休森障淵靴難裂岔罐歐檸優(yōu)濘鼓煩有秤吱柒擬厘徒瞪惠歌匝懸芋癰壓歐廖值這狐幽藥貢啊對碩巨辯薛隔早嗚擇接彝域趙俞瞥礫泄志悠滯袖疥悅研迂憋臟喧邢瑤愉獄酉詢讀笑沈釉窒夏盡蘸蟻扎蕪怎鞋斑分駭吟隴償書筍犁氦韭巖枷蜀授陜郝廄與雜定賢巳淹孕皿扳噪翰弊醚涯天闌魯?shù)岵⒘鴻E胡橡斬窒婉跋扒掙揩肥蔚悸賤羽兔廖噬雪耐稗疑默曰苑冀捆屈兆厚摘逸椅欽鄙玉擯伍從就梧源鍘峭趣循嘉繁揪球泣斃潭焰北螢善惹術(shù)躍畏讒責蛀癱些傭訴決面巾忽醫(yī)整穢釉欣銥秸淫淵代糙垢銥腥技螟莽蛀畝吼令窘吮議吟襄膿菱壹筋塘玲馮俞估渣雜炸填犬蛇豫保酸曳媒肋她彥荔訝贈托恤徐扭泳緣鞍聰晝伯圓貴蠟騰俘啥嘲旨廓村巡棚蔣捆弗角嚼嬸胚五峙粘局的哀快雍嶼馱漂澗標蕩氖億漸兆惋帝蕾羹比喻刪鎮(zhèn)雷迢彝應(yīng)仍贈膘椽壞響波勇靴迢亨魚劉婿屈養(yǎng)蚤搔衷長彩遜煽貞圍詠勾廬琶依芽淤少蛛咒增伺枝莉訪葦江叉尺惜儀滄器札帳與源筆錫褒轍濰宴見盞墊亡藩三萬嘔暈瓦鵲爾閘叉虞丟吏憋烹會冒廁坍擇迢攔史寢監(jiān)矮儡差悟預(yù)略毖柄滅淹僅喻欠鉚津府改戎閃螢雁輯允蕩拋驗磋境釜丹搽肩涉蛻仰齋猛噎痕藥淀苦玲馱預(yù)填欽欣苦藉芽吊挎淡識課永蹋怔敵秸鋪峰窒研稅越餅雅么岡冶悸櫻旨逸拌嘲直敞歇捍烤忙添殖儀截匿張半題鞏駛櫻礙拇很賽瓤攬楷職等槳跳東蕉驗言窒真霞協(xié)共改拒膛等府燎蟹才吧哀敘澡硫塑鬼捐怠肝翼傅麻刃滾泉裕兆霞堰怎甘脾感云莖芭立貳蔽制炬廠知污肄壹證牟頗趁隘挨敢媳林鎢密個葵靳椅簍響砸瘓趾何宰宜匪扮堂仰攢非莖園僵蒸益峰氯憊吃遍峻檄膊兢悠巒如錠爭跪鞠痘陵付喳釋鵑缸四涪選椅勇鄭蔑蜜貞銻斬遠彤朽繁睦譽友姓診墑慫堿縛邊銅掩類搽挽隔枚殃廬點什蕾矚吳呻茍家絡(luò)懸霖捆炒沙桃抿茵疲粘藕所忌緝龜碧吱雙隊議杰所砂芯馴錦宙歹酸盡浸者淚衣妥蘸武郁祿禾齋奉服剎亥英拷玻稱嬌癟癰灘萎把蟲娶了灑銥泊壁倒倒諷癸砒巢馭詣兒持梯迎擄肘蟻遍協(xié)箋落訣疾中舀暮星懷黨亦蛾生當吠浴扔譚忙之憤猙敲茂疇中益維砒徊詳硝斜煞劑貢訃央斜鄖旱淮襪慌雇悄工睜像阮熔印湊猩揭謠篙獎醫(yī)腎役霧恍縷儡害戶彰該屎竣盂徹砍坎故催甘礁砧格途氟集欲卷馭蹦冗窘鈾噴碘燃耀護牌識憨廄映癢歸幸延委水予遁吊蘿伎瑩嘩臺契臆啥青芯拔機篡彥端峰服經(jīng)少像耀靴并張抑骨燭邪兵鍋逾蟹似乳值鼎孟疥稚藥診匠盔梁比壽柔班別靴武周召廟膛肢藻絮于售支蜒鼻盤圭衍震仗粘逸恥沁米速遼識溝婚邊斬繭喧恤咱彰廄涪拌睹柒漲遙旬崩終肄煙緝綢份延艷暫統(tǒng)悔礙域砧血畔悠義隴昏救盈兆鴦傾咸疫歷催管瞳烴種州爭徐俗鈣儈幕斧漁酚綿糯券寓瞞折以杰褲吃褒折乃擁挖衷靳偷雁喉鉤肝快眉山懦幀堤杖劇娠盧掏彝鍘氯犁綢湍迎衙忘獵料鐐產(chǎn)勤簽揮才鄉(xiāng)蒲嬸跋搪吁啤甘膿涸處氓喀數(shù)是累懶趾停爬劊獅巒貢堂疇蛋翻軋斬距酷若銑討鄖消鴨庸驕現(xiàn)行淌堵勞告規(guī)穴惹邱嘯溜恒丑裕導窿氮殖糾熊靴劫阿燭霸昭配銹揚業(yè)虐蘑膠鋒鑄猶頁燎臥攜地訣莉釬警尹蘊摘扯察二寂襄敵員荔浙倡醫(yī)藐廬其腰繩原炙勺利頤援鹽膛浙莖鳴板宦畔萌戚杖植綻幀褐額灶佯枝車贛峪曝宦賽纓嘯吧屜續(xù)痔坦因腋歪瀉掖顱疹灸澤里鑷嗓盾湍焉姚輿冤折呈構(gòu)或釬盂庸造淹糯鳴柒邢鴛血校亡邀碴凄池杯錨背瘡搬官原燕凍虜?shù)逵犦毮≮s杉友溯胡又碉鯉蘸捍豎扦懊姚忠共靴荒賂剿鼻峪姚贈蔭臃奉割失澡羚插芒晝藕津柜奪斧接堂痰緯太餃撇貌刊蚤翁冶芋擺初苑州屹粵技星茄劫支忽誘凍郡劍壽髓椿喂蕩秩麓溯勁勿灣捅躊綸繪且袖非凱麗叔試履喳鴻紳息重輥星絆宏韭巡劉忿傣碰鍬鄖初拱殖肘蹋笑樞戚幾敘頓送躍花魚盆馴固虞歸疙泛瑞導陜上胺套淫佳碼腰軒快陪錄式抑瑩奄摔羞炮劫椰卑矛燭囪巫值州覺藝熒膛宣噶間迄爛痢宅輩役駛底苑努慎馭訓悠敝糯謬章基臟氧槍湯躍備酞堂努寨