紫貽貝中毒素成分提取及其初步鑒定

紫貽貝中毒素成分提取及其初步鑒定

近年來，隨著現(xiàn)代分離純度技術(shù)的快速發(fā)展，相關(guān)貝毒研究也越來越深入。關(guān)于某些類型的有毒藥物和一些結(jié)構(gòu)創(chuàng)新藥物，已經(jīng)發(fā)表了幾篇報告。AZP(azaspiracidshellfishpoisoning)就是最近幾年才從歐洲沿海國家的養(yǎng)殖貝類中發(fā)現(xiàn)的一類新貝毒。1995年11月,荷蘭至少有8人因食用從愛爾蘭Killary港進口的養(yǎng)殖紫貽貝(Mytilusedulis)而患病。1997年9～10月,愛爾蘭西北部Donegal縣Arranmore島至少有12人因食用染毒的紫貽貝而患病。隨后,法國、意大利和英國等也陸續(xù)報道了此類中毒事件。1996年2月,Yasumoto等從采自Killary港的紫貽貝中分離得到了azaspiracid(簡稱AZA1)及兩種類似物AZA2和AZA3,并命名為Killarytoxin-3(KT-3)。由于AZAs(AZA1及其類似物的統(tǒng)稱)和腹瀉性貝毒(DSP)引起的人體中毒癥狀極其相似,一些學(xué)者最初把AZAs當(dāng)作腹瀉性貝毒的新成員。進一步研究發(fā)現(xiàn),AZAs具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性,與人們早已熟知的麻痹性貝毒(PSP)、腹瀉性貝毒(DSP)、神經(jīng)性貝毒(NSP)、記憶缺失性貝毒(ASP)和西加魚毒(CFP)有著明顯的區(qū)別,因此把由AZAs引起的人員中毒事件稱為AZP。本文根據(jù)國外近年來的最新研究成果,對AZAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)、來源、地理分布、毒性效應(yīng)、檢測方法及作用機制等方面的研究進展作簡單介紹,并對我國開展AZP研究的重點領(lǐng)域提出建議,以期能引起我國科學(xué)界和政府有關(guān)部門的足夠重視,迅速采取行動做好防治工作,以保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全和消費者身體健康。1結(jié)構(gòu)和性能1.1azs的結(jié)構(gòu)采用高分辨率快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)、二維核磁共振(2D-NMR)和碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)測定了AZAs的結(jié)構(gòu)。AZAs是一類脂溶性聚醚化合物,無色非晶質(zhì)固體,其碳骨架由40個碳原子組成,分子中有20個立體異構(gòu)中心和9個環(huán)(如圖1)。迄今為止,研究人員已從染毒的貝類組織中分離得到了11種毒素成分(見表1)。從浮游植物細(xì)胞中提取出了AZA1、AZA2和AZA3三種成分,推測AZA4、AZA5、AZA7、AZA8、AZA9和AZA10可能是貝類體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。1.2整貝az及其類毒素的測定AZAs毒性比較穩(wěn)定,常規(guī)的烹飪和加工處理無法去除,其毒性遠比大田軟海綿酸(OA)強,目前還沒有找到有效的治療方法和治療藥物。該類毒素有時還與OA、扇貝毒素(PTXs)和蝦夷扇貝毒素(YTXs)同時存在于貝類中,易被腹瀉性貝毒所掩飾,采自挪威的貽貝中曾同時檢出了AZA、OA、PTXs和YTXs。為了保障消費者的健康安全,愛爾蘭食品安全局(FSAI)提議,整貝AZAs的閾值濃度暫定為100×10-9,根據(jù)新的研究結(jié)果進行再修訂。2002年3月,歐洲委員會規(guī)定雙殼類、棘皮動物、被囊類和海洋腹足動物(全體或任何可食部分)AZAs的最大允許濃度為160×10-9。不同成分的毒性差異很大,AZA2和AZA3均比AZA1毒性強,AZA1、AZA2和AZA3對小白鼠的最小致死劑量分別為0.2×10-6、0.11×10-6和0.14×10-6。與其它聚醚類毒素主要分布于貝類消化腺中不同,AZAs遍及貝類全部組織。在染毒初期AZAs集中分布于貝類消化腺中,后期則轉(zhuǎn)移到其它組織(如肌肉)中,毒性可在貝體內(nèi)持續(xù)存留8個月之久,自然凈化速率非常慢。不同成分分布于貝類的不同組織中,AZA1主要分布于消化腺,而AZA3則主要分布于消化腺以外的其它組織。2來源和分布2.1厚甲原多甲藻細(xì)胞中azs的表達AZAs的生物起源目前還沒有明確定論。據(jù)報道,原多甲藻屬(Protoperidinium)的某些種類能夠產(chǎn)生AZAs。原多甲藻屬在分類學(xué)上隸屬于甲藻門(Dinophyta)、橫裂甲藻綱(Dinophyceae)、多甲藻目(Peridiniales)、多甲藻科(Peridiniaceae),有記錄的種類達60多種,營異養(yǎng)生活。從厚甲原多甲藻(P.crassipes)細(xì)胞中提取出了AZA1、AZA2和AZA3三種成分,并測得AZAs的平均含量為1.8×10-15mol/cell,其中,AZA1占總量的82%。這表明,厚甲原多甲藻可產(chǎn)生AZAs。其它浮游植物是否也能產(chǎn)生AZAs目前還不清楚,有待于進一步研究。2.2毒素類毒素檢測AZAs最初從愛爾蘭西海岸的紫貽貝中檢出。近年來,養(yǎng)殖貝類染毒的區(qū)域正在逐步擴大,染毒貝類的種類也逐漸增多。在英國、挪威、法國和西班牙等國家的養(yǎng)殖貝類中也檢出了AZAs。紫貽貝、貽貝(Mytilusgalloprovincialis)、長牡蠣[Ostrea(Crassostrea)gigas]和大扇貝(Pectenmaximus)等均檢出含有該類毒素,甚至達到了較高的濃度水平。例如,在英國Craster和挪威松恩峽灣的紫貽貝肝胰腺中,毒素的總含量分別為0.24×10-6和0.82×10-6;在法國布列塔尼半島大扇貝和西班牙加利西亞省Riadevigo海區(qū)貽貝的消化腺中,毒素的總含量分別為0.32×10-6和0.24×10-6。3毒性反應(yīng)3.1細(xì)菌腸毒素安全性分析AZAs主要引起人體胃腸道紊亂,與腹瀉性貝毒(DSP)和細(xì)菌性腸毒素引起的人體中毒癥狀極其相似。通常在進食12～24h后發(fā)作,主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、胃絞痛、發(fā)冷和頭痛,持續(xù)時間短則1～2d,最長可達3～5d。3.2神經(jīng)毒效應(yīng)表現(xiàn)受試小白鼠不出現(xiàn)腹瀉癥狀,而出現(xiàn)類似于麻痹性貝毒(PSP)引起的中毒癥狀,并表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒效應(yīng)。AZAs能導(dǎo)致多種器官損傷,小腸、胃、肺、肝、胰、胸腺和脾等為主要的靶器官,主要病理變化包括小腸粘膜層壞死、胸腺和脾的淋巴細(xì)胞壞死、肝脂肪變化、間質(zhì)性肺炎和肺腫瘤等。4質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)目前,對AZP的檢測方法基本上集中于小鼠生物測定法和高效液相色譜法(HPLC),尤其以高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)的應(yīng)用最為廣泛。由愛爾蘭食品安全促進委員會資助,愛爾蘭戈爾韋海洋研究所(IMR)和英國貝爾法斯特皇后大學(xué)獸醫(yī)系(VSD)共同承擔(dān)的RASTA項目(2001年9月～2004年8月)試圖建立一種快速、靈敏、特異的免疫學(xué)檢測方法。細(xì)胞毒性試驗和蛋白磷酸酶抑制試驗等也正處于探索之中。4.1小鼠生物測定法小鼠生物測定法的原理是,采用適宜的化學(xué)提取方法,將樣品(有毒藻類或染毒貝類)中的毒素轉(zhuǎn)移到提取液中,通過向固定種系和體重的小白鼠腹腔注射提取液,記錄小白鼠的存活時間以計算樣品的毒素含量。小鼠生物測定法是目前最常用的貝毒分析方法,并被美國分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)列為PSP的常規(guī)檢測方法。小鼠生物測定法具有可靠性強、使用廣泛、能表達出樣品中實際毒性、不需復(fù)雜設(shè)備等優(yōu)點;但不夠靈敏、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差、試驗需處理大量動物、不能判定各毒素的成分、操作技巧要求較高、對試驗動物的種系及體重要求苛刻。傳統(tǒng)的小鼠生物測試法只用肝胰腺做測定,只能檢測到貝類組織中AZA總量的0%～40%,因此存在較高比例的假陰性結(jié)果。4.2標(biāo)準(zhǔn)毒素l-mb法HPLC方法的原理是,利用毒素分子上的羧基與熒光物質(zhì)反應(yīng),生成強熒光物質(zhì),再進行檢測。HPLC法具有靈敏、準(zhǔn)確、可靠、特異性和重現(xiàn)性好、能確定各種毒素成分、使用廣泛、易校正、所需檢測的樣品量少等優(yōu)點;但毒素標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴、樣品前處理要求較高、需昂貴的設(shè)備及高素質(zhì)的操作人員。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MSn)不需使用標(biāo)準(zhǔn)毒素,特別適用于確認(rèn)毒素和鑒別新毒素。LC/MS法對AZA1的檢測限為50×10-12g,靈敏度為小鼠生物測試的80000倍。Micro-LC-MS-MS法對AZA1的檢測限為20×10-12g。四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(triple-quadrupolemassspectrometer)可以檢測到10-15g濃度水平。5az1對人細(xì)胞免疫組化的影響AZAs的作用機制及其在貝體內(nèi)的動力學(xué)過程正處于探索階段。Roman等研究了AZA1對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-M17細(xì)胞系的細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位和F-肌動蛋白水平的影響,結(jié)果表明:AZA1對細(xì)胞膜電位沒有任何改變,也不改變線粒體的活性,引起F-肌動蛋白濃度降低。Roman等采用熒光顯微技術(shù)研究了AZA1對人淋巴細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、胞液Ca2+和胞液pH值(pHi)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):AZA1引起cAMP和Ca2+增加,對pHi沒有影響;cAMP不受細(xì)胞外Ca2+的影響;Ca2+受細(xì)胞內(nèi)鈣離子庫中鈣的釋放和通過Ni2+阻斷通道從細(xì)胞外介質(zhì)流入的Ca2+的共同影響,PKC的活化作用、PP1和PP2A的抑制作用以及cAMP的累積對胞液Ca2+具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。6海洋微藻的研究建議由于我國對AZP缺乏足夠的認(rèn)識和了解,相關(guān)工作也還未開展,所以目前無法確定我國海域是否有產(chǎn)毒的原多甲藻分布,也不清楚AZAs是否影響到我國的海產(chǎn)品質(zhì)量安全。據(jù)文獻記載,原多甲藻屬的一些種類在我國近岸海域分布廣泛。國際現(xiàn)代海運事業(yè)的蓬勃發(fā)展又為廣適性的海洋微藻的跨境轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利條件。因此,不能完全排除我國將來受到AZP危害的可能。為此,作者建議在我國迅速著手開展一些針對性的研究工作:(1)我國海域原多甲藻屬的種類及地理分布,尤其是厚甲原多甲藻的分布區(qū)域;(2)原多甲藻的生物學(xué)和生理生態(tài)學(xué)研究,如生長特性、生活史、種群