紫貽貝中毒素成分提取及其初步鑒定

紫貽貝中毒素成分提取及其初步鑒定

近年來，隨著現(xiàn)代分離純度技術(shù)的快速發(fā)展，相關(guān)貝毒研究也越來越深入。關(guān)于某些類型的有毒藥物和一些結(jié)構(gòu)創(chuàng)新藥物，已經(jīng)發(fā)表了幾篇報(bào)告。AZP(azaspiracidshellfishpoisoning)就是最近幾年才從歐洲沿海國(guó)家的養(yǎng)殖貝類中發(fā)現(xiàn)的一類新貝毒。1995年11月,荷蘭至少有8人因食用從愛爾蘭Killary港進(jìn)口的養(yǎng)殖紫貽貝(Mytilusedulis)而患病。1997年9～10月,愛爾蘭西北部Donegal縣Arranmore島至少有12人因食用染毒的紫貽貝而患病。隨后,法國(guó)、意大利和英國(guó)等也陸續(xù)報(bào)道了此類中毒事件。1996年2月,Yasumoto等從采自Killary港的紫貽貝中分離得到了azaspiracid(簡(jiǎn)稱AZA1)及兩種類似物AZA2和AZA3,并命名為Killarytoxin-3(KT-3)。由于AZAs(AZA1及其類似物的統(tǒng)稱)和腹瀉性貝毒(DSP)引起的人體中毒癥狀極其相似,一些學(xué)者最初把AZAs當(dāng)作腹瀉性貝毒的新成員。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AZAs具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性,與人們?cè)缫咽熘穆楸孕载惗?PSP)、腹瀉性貝毒(DSP)、神經(jīng)性貝毒(NSP)、記憶缺失性貝毒(ASP)和西加魚毒(CFP)有著明顯的區(qū)別,因此把由AZAs引起的人員中毒事件稱為AZP。本文根據(jù)國(guó)外近年來的最新研究成果,對(duì)AZAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)、來源、地理分布、毒性效應(yīng)、檢測(cè)方法及作用機(jī)制等方面的研究進(jìn)展作簡(jiǎn)單介紹,并對(duì)我國(guó)開展AZP研究的重點(diǎn)領(lǐng)域提出建議,以期能引起我國(guó)科學(xué)界和政府有關(guān)部門的足夠重視,迅速采取行動(dòng)做好防治工作,以保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全和消費(fèi)者身體健康。1結(jié)構(gòu)和性能1.1azs的結(jié)構(gòu)采用高分辨率快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)、二維核磁共振(2D-NMR)和碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)測(cè)定了AZAs的結(jié)構(gòu)。AZAs是一類脂溶性聚醚化合物,無色非晶質(zhì)固體,其碳骨架由40個(gè)碳原子組成,分子中有20個(gè)立體異構(gòu)中心和9個(gè)環(huán)(如圖1)。迄今為止,研究人員已從染毒的貝類組織中分離得到了11種毒素成分(見表1)。從浮游植物細(xì)胞中提取出了AZA1、AZA2和AZA3三種成分,推測(cè)AZA4、AZA5、AZA7、AZA8、AZA9和AZA10可能是貝類體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。1.2整貝az及其類毒素的測(cè)定AZAs毒性比較穩(wěn)定,常規(guī)的烹飪和加工處理無法去除,其毒性遠(yuǎn)比大田軟海綿酸(OA)強(qiáng),目前還沒有找到有效的治療方法和治療藥物。該類毒素有時(shí)還與OA、扇貝毒素(PTXs)和蝦夷扇貝毒素(YTXs)同時(shí)存在于貝類中,易被腹瀉性貝毒所掩飾,采自挪威的貽貝中曾同時(shí)檢出了AZA、OA、PTXs和YTXs。為了保障消費(fèi)者的健康安全,愛爾蘭食品安全局(FSAI)提議,整貝AZAs的閾值濃度暫定為100×10-9,根據(jù)新的研究結(jié)果進(jìn)行再修訂。2002年3月,歐洲委員會(huì)規(guī)定雙殼類、棘皮動(dòng)物、被囊類和海洋腹足動(dòng)物(全體或任何可食部分)AZAs的最大允許濃度為160×10-9。不同成分的毒性差異很大,AZA2和AZA3均比AZA1毒性強(qiáng),AZA1、AZA2和AZA3對(duì)小白鼠的最小致死劑量分別為0.2×10-6、0.11×10-6和0.14×10-6。與其它聚醚類毒素主要分布于貝類消化腺中不同,AZAs遍及貝類全部組織。在染毒初期AZAs集中分布于貝類消化腺中,后期則轉(zhuǎn)移到其它組織(如肌肉)中,毒性可在貝體內(nèi)持續(xù)存留8個(gè)月之久,自然凈化速率非常慢。不同成分分布于貝類的不同組織中,AZA1主要分布于消化腺,而AZA3則主要分布于消化腺以外的其它組織。2來源和分布2.1厚甲原多甲藻細(xì)胞中azs的表達(dá)AZAs的生物起源目前還沒有明確定論。據(jù)報(bào)道,原多甲藻屬(Protoperidinium)的某些種類能夠產(chǎn)生AZAs。原多甲藻屬在分類學(xué)上隸屬于甲藻門(Dinophyta)、橫裂甲藻綱(Dinophyceae)、多甲藻目(Peridiniales)、多甲藻科(Peridiniaceae),有記錄的種類達(dá)60多種,營(yíng)異養(yǎng)生活。從厚甲原多甲藻(P.crassipes)細(xì)胞中提取出了AZA1、AZA2和AZA3三種成分,并測(cè)得AZAs的平均含量為1.8×10-15mol/cell,其中,AZA1占總量的82%。這表明,厚甲原多甲藻可產(chǎn)生AZAs。其它浮游植物是否也能產(chǎn)生AZAs目前還不清楚,有待于進(jìn)一步研究。2.2毒素類毒素檢測(cè)AZAs最初從愛爾蘭西海岸的紫貽貝中檢出。近年來,養(yǎng)殖貝類染毒的區(qū)域正在逐步擴(kuò)大,染毒貝類的種類也逐漸增多。在英國(guó)、挪威、法國(guó)和西班牙等國(guó)家的養(yǎng)殖貝類中也檢出了AZAs。紫貽貝、貽貝(Mytilusgalloprovincialis)、長(zhǎng)牡蠣[Ostrea(Crassostrea)gigas]和大扇貝(Pectenmaximus)等均檢出含有該類毒素,甚至達(dá)到了較高的濃度水平。例如,在英國(guó)Craster和挪威松恩峽灣的紫貽貝肝胰腺中,毒素的總含量分別為0.24×10-6和0.82×10-6;在法國(guó)布列塔尼半島大扇貝和西班牙加利西亞省Riadevigo海區(qū)貽貝的消化腺中,毒素的總含量分別為0.32×10-6和0.24×10-6。3毒性反應(yīng)3.1細(xì)菌腸毒素安全性分析AZAs主要引起人體胃腸道紊亂,與腹瀉性貝毒(DSP)和細(xì)菌性腸毒素引起的人體中毒癥狀極其相似。通常在進(jìn)食12～24h后發(fā)作,主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、胃絞痛、發(fā)冷和頭痛,持續(xù)時(shí)間短則1～2d,最長(zhǎng)可達(dá)3～5d。3.2神經(jīng)毒效應(yīng)表現(xiàn)受試小白鼠不出現(xiàn)腹瀉癥狀,而出現(xiàn)類似于麻痹性貝毒(PSP)引起的中毒癥狀,并表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒效應(yīng)。AZAs能導(dǎo)致多種器官損傷,小腸、胃、肺、肝、胰、胸腺和脾等為主要的靶器官,主要病理變化包括小腸粘膜層壞死、胸腺和脾的淋巴細(xì)胞壞死、肝脂肪變化、間質(zhì)性肺炎和肺腫瘤等。4質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)目前,對(duì)AZP的檢測(cè)方法基本上集中于小鼠生物測(cè)定法和高效液相色譜法(HPLC),尤其以高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)的應(yīng)用最為廣泛。由愛爾蘭食品安全促進(jìn)委員會(huì)資助,愛爾蘭戈?duì)栱f海洋研究所(IMR)和英國(guó)貝爾法斯特皇后大學(xué)獸醫(yī)系(VSD)共同承擔(dān)的RASTA項(xiàng)目(2001年9月～2004年8月)試圖建立一種快速、靈敏、特異的免疫學(xué)檢測(cè)方法。細(xì)胞毒性試驗(yàn)和蛋白磷酸酶抑制試驗(yàn)等也正處于探索之中。4.1小鼠生物測(cè)定法小鼠生物測(cè)定法的原理是,采用適宜的化學(xué)提取方法,將樣品(有毒藻類或染毒貝類)中的毒素轉(zhuǎn)移到提取液中,通過向固定種系和體重的小白鼠腹腔注射提取液,記錄小白鼠的存活時(shí)間以計(jì)算樣品的毒素含量。小鼠生物測(cè)定法是目前最常用的貝毒分析方法,并被美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)列為PSP的常規(guī)檢測(cè)方法。小鼠生物測(cè)定法具有可靠性強(qiáng)、使用廣泛、能表達(dá)出樣品中實(shí)際毒性、不需復(fù)雜設(shè)備等優(yōu)點(diǎn);但不夠靈敏、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差、試驗(yàn)需處理大量動(dòng)物、不能判定各毒素的成分、操作技巧要求較高、對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的種系及體重要求苛刻。傳統(tǒng)的小鼠生物測(cè)試法只用肝胰腺做測(cè)定,只能檢測(cè)到貝類組織中AZA總量的0%～40%,因此存在較高比例的假陰性結(jié)果。4.2標(biāo)準(zhǔn)毒素l-mb法HPLC方法的原理是,利用毒素分子上的羧基與熒光物質(zhì)反應(yīng),生成強(qiáng)熒光物質(zhì),再進(jìn)行檢測(cè)。HPLC法具有靈敏、準(zhǔn)確、可靠、特異性和重現(xiàn)性好、能確定各種毒素成分、使用廣泛、易校正、所需檢測(cè)的樣品量少等優(yōu)點(diǎn);但毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴、樣品前處理要求較高、需昂貴的設(shè)備及高素質(zhì)的操作人員。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MSn)不需使用標(biāo)準(zhǔn)毒素,特別適用于確認(rèn)毒素和鑒別新毒素。LC/MS法對(duì)AZA1的檢測(cè)限為50×10-12g,靈敏度為小鼠生物測(cè)試的80000倍。Micro-LC-MS-MS法對(duì)AZA1的檢測(cè)限為20×10-12g。四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(triple-quadrupolemassspectrometer)可以檢測(cè)到10-15g濃度水平。5az1對(duì)人細(xì)胞免疫組化的影響AZAs的作用機(jī)制及其在貝體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程正處于探索階段。Roman等研究了AZA1對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-M17細(xì)胞系的細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位和F-肌動(dòng)蛋白水平的影響,結(jié)果表明:AZA1對(duì)細(xì)胞膜電位沒有任何改變,也不改變線粒體的活性,引起F-肌動(dòng)蛋白濃度降低。Roman等采用熒光顯微技術(shù)研究了AZA1對(duì)人淋巴細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、胞液Ca2+和胞液pH值(pHi)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):AZA1引起cAMP和Ca2+增加,對(duì)pHi沒有影響;cAMP不受細(xì)胞外Ca2+的影響;Ca2+受細(xì)胞內(nèi)鈣離子庫(kù)中鈣的釋放和通過Ni2+阻斷通道從細(xì)胞外介質(zhì)流入的Ca2+的共同影響,PKC的活化作用、PP1和PP2A的抑制作用以及cAMP的累積對(duì)胞液Ca2+具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。6海洋微藻的研究建議由于我國(guó)對(duì)AZP缺乏足夠的認(rèn)識(shí)和了解,相關(guān)工作也還未開展,所以目前無法確定我國(guó)海域是否有產(chǎn)毒的原多甲藻分布,也不清楚AZAs是否影響到我國(guó)的海產(chǎn)品質(zhì)量安全。據(jù)文獻(xiàn)記載,原多甲藻屬的一些種類在我國(guó)近岸海域分布廣泛。國(guó)際現(xiàn)代海運(yùn)事業(yè)的蓬勃發(fā)展又為廣適性的海洋微藻的跨境轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利條件。因此,不能完全排除我國(guó)將來受到AZP危害的可能。為此,作者建議在我國(guó)迅速著手開展一些針對(duì)性的研究工作:(1)我國(guó)海域原多甲藻屬的種類及地理分布,尤其是厚甲原多甲藻的分布區(qū)域;(2)原多甲藻的生物學(xué)和生理生態(tài)學(xué)研究,如生長(zhǎng)特性、生活史、種群