基于ssr引物的保持池和恢復池的多態(tài)性分析

基于ssr引物的保持池和恢復池的多態(tài)性分析

植物細胞的不良性育種利用是小麥混合優(yōu)勢方法的有效手段。它避免了人工雄花的人工去除過程、工作量、效率低下，以及化學雄花的長期破壞。因此，它的應用前景非常廣闊。V型小麥細胞質(zhì)雄性不育系(V-CMS)與T型小麥細胞質(zhì)雄性不育系(T-CMS)相比優(yōu)點更多,它沒有明顯的不良胞質(zhì)效應,易恢復且恢復源廣,不育系種子飽滿,有很好的利用前景?；謴拖档倪x育是利用CMS系統(tǒng)配制雜交種的前提之一,而選育恢復系比常規(guī)育種具有更多的困難,主要表現(xiàn)在恢復基因的有無只能在測交后代中鑒定,加上分離世代不可能逐株測交。利用DNA分子標記能在幼苗期對分離世代的植株進行鑒定,通過篩選與育性恢復基因連鎖的DNA分子標記,可以對恢復基因進行精確定位,并為最終克隆育性恢復基因打下基礎。目前利用DNA分子標記對CMS恢復基因的定位研究在水稻、玉米、油菜、黑麥、甜乘、向日葵等作物上都取得了很大進展,在小麥CMS育性恢復基因的定位研究中,對T-CMS研究的最早也最深入。近年來利用DNA分子標記對K-CMS的恢復基因也有了一定研究,但是利用DNA分子標記對V-CMS恢復基因的研究還未見報道。SSR是近年來發(fā)展起來的一類理想的DNA分子標記。本試驗利用SSR分子標記對V-CMS恢復系濟南13的恢復基因進行了定位分析。1材料和方法1.1恢復池的制備V911289A是偏凸山羊草細胞質(zhì)的小麥雄性不育系,97美斯6對V911289A有保持能力,濟南13對V型不育系具有較高的恢復力。2001年配制(濟南13/97美斯6)F1,2002年以V911289A為母本,以(濟南13/97美斯6)F1為父本進行測交,2003年對測交單株進行掛牌編號及套袋自交,提取相應單株的DNA,成熟后按國內(nèi)法考查各株的套袋自交結實率。結實率大于70%的極端類型含有主效育性恢復基因作為可育株,不結實的完全不育株不含有主效恢復基因。選取自交不結實的15個單株,每株取等量DNA混合構建保持池;選取自交結實率大于75%的15個單株,每株取等量DNA混合構建恢復池。在親本和兩個池中用SSR標記篩選多態(tài)性差異,篩選到穩(wěn)定差異標記,再對測交群體進行分析。1.2ssr-pcr擴增所用SSR引物是根據(jù)R?der(1998)等報道的序列經(jīng)上海生物工程有限公司合成的。SSR標記的PCR擴增反應在BiometraT1Thermo-cycler上進行,反應體系為25μl,模板DNA90ng,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,2.0mmol/LMgCl2,0.15mmol/LdNTP,50ngPrimers,1UTaqDNA聚合酶。PCR擴增條件為:94℃預變性3min;94℃變性1min,50、55℃或60℃退火1min(退火溫度因引物不同而不同),72℃延伸2min,共進行35個循環(huán);72℃后延伸10min。SSR擴增產(chǎn)物采用4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠恒功率(80W)電泳約50min,銀染檢測。聚丙烯酰胺凝膠銀染程序:10%的醋酸1000ml固定20min,去離子水漂洗10min,0.12%硝酸銀1000ml(加入2ml的甲醛)染色30min,用去離子水快速漂洗5s,然后用3%的碳酸鈉溶液1000ml(預冷至10℃以下,臨用前加入0.8ml甲醛,200μl10%硫代硫酸鈉溶液)顯影至DNA帶型清晰,加入10%的醋酸3min終止反應,最后用去離子水漂洗約10min。2結果與分析2.1主效恢復基因和微效基因共同控制v型育性恢復考查了250個(V911289A//濟南13/97美斯6)測交單株的自交結實率,其結實率呈連續(xù)分布(圖1),但不呈正態(tài)分布,在0%和60%各有一個峰值,且前者峰值較高,說明濟南13對V型不育系的育性恢復受主效恢復基因和眾多微效基因共同控制。在250個測交單株中,結實率低于60%的有175株,而結實率高于80%的僅有26株,由此也說明濟南13對V911289的恢復力并不是很強,還需要選育恢復力更強的恢復系。2.2擴增位點xgwm264利用SSR引物對親本濟南13和97美斯6以及保持池和恢復池進行了篩選,發(fā)現(xiàn)SSR引物GWM11、GWM18、GWM264和GWM273的擴增位點Xgwm11、Xgwm18、Xgwm264和Xgwm273在兩親本(濟南13和97美斯6)之間都有穩(wěn)定的差異,但通過分離群體驗證后發(fā)現(xiàn)它們的交換值分別為78.9%、78.1%、79.8%和76.3%,都大于50%(圖2),超過了遺傳交換的理論界限,出現(xiàn)了一種令人難以想象的結果。3恢復系的分子檢測1999年柴守誠等對K、V型不育系育性恢復進行了比較研究,發(fā)現(xiàn)K型不育系的育性恢復主要受1BS上的Rfv1基因控制,而V型不育系的育性恢復則受Rfv1和1D染色體上的育性恢復基因共同控制,并且認為二者具有互補性和累加性,比K型不育系更復雜,而且發(fā)現(xiàn)在保持1D正常劑量的情況下,使恢復系中攜帶Rfv1的1B染色體(片斷)加倍能夠提高V型不育系的恢復度。但在本研究中只是在1BS上發(fā)現(xiàn)了有差異的標記,但在1DS上并未發(fā)現(xiàn)。于天峰在研究中發(fā)現(xiàn),V型不育系的恢復源較廣,但具有高恢復度的恢復源不多,不同的材料恢復力差別很大,并且發(fā)現(xiàn)恢復力高的恢復系都具有兩對獨立遺傳的主效基因,而低恢復力的恢復系只含有一對主效基因。本試驗通過對測交后代自交結實率分析發(fā)現(xiàn),在250個單株中結實率大于10%的單株有176株,占到了70.4%,但是結實率大于80%的單株只有26株,僅占10.4%?？梢钥闯鰸?3能夠恢復V91128A的育性,但是恢復度并不很高,所以濟南13很可能只有一對育性恢復基因。本研究在1BS上找到的在兩親本(濟南13和97美斯6)之間有差異的4個SSR引物,恰好與劉保申等找到的與K型不育系育性恢復基因有連鎖關系的引物一樣,在分子水平也驗證了K、V型不育系具有很大的相似性。但通過分離群體驗證后發(fā)現(xiàn)它們的交換值都大于50%,超出了遺傳交換的理論界限(50%),這應該是不可能的。在分離群體驗證中我們也發(fā)現(xiàn),在不育群體中出現(xiàn)了多數(shù)與恢復系親本濟南13相同的帶,而在可育群體中出現(xiàn)了多數(shù)與保持系97美斯6相同的帶,與理論情況正好相反(如圖2)。出現(xiàn)這種怪異的現(xiàn)象可能有以下原因:(1)恢復系和保持系的DNA樣顛倒了。如果把這兩親本的帶型反過來分析,這4個引物的擴增位點與恢復基因間的交換值就變成了21.1%、21.9%、20.2%和23.7%,這樣就完全符合理論交換值的要求了。但是經(jīng)過我們多次重新提取這兩親本的DNA樣進行驗證,確認親本DNA樣并沒有顛倒。(2)測交單株自交結實率考種的結果不準確。但是根據(jù)連續(xù)兩年的重復測交、考種的結果確定的極端分離群體中出現(xiàn)的帶型趨勢基本相同。而且,如果只是因為考種結果不準確的原因,很難出現(xiàn)在不育群體中有多數(shù)可育