液相色譜分離的溶劑效應(yīng)

液相色譜分離的溶劑效應(yīng)"溶劑效應(yīng)”會致使哪些峰形異樣？如何幸免溶劑效應(yīng)？在HPLC分析中樣品溶劑的選擇和流動相是如何的聯(lián)系？為何建議利用流動相溶解樣品？。。。。。一系列的問題都和樣品溶劑的選擇緊密相關(guān)，如何解決真正的溶劑效應(yīng)問題，又如何分辨哪些是非溶劑效應(yīng)問題，不同的問題有不同的解決方式，有哪些先輩留下的實戰(zhàn)體會可供分享呢？一路來看看吧！什么是溶劑效應(yīng)？樣品溶液的溶劑強度強于流動相溶劑強度時可能會造成的峰展寬、峰分叉現(xiàn)象。即色譜圖上較早洗脫的峰前沿或開叉，與此同時較晚洗脫的峰那么較為正常的現(xiàn)象。例如樣品溶液的溶劑是100%乙腈（100%的強溶劑），而流動相的組成那么較弱，18%的乙腈與72%的水。第一個峰是開叉的，而且與第二個峰相較，明顯地變寬了。當樣品溶液的溶劑變成流動相時，所有的峰形都改善了，且變得尖銳。溶質(zhì)溶劑性質(zhì)對溶解度的影響溶質(zhì)A溶制B相互作用A在B中的溶解度A…AB??EA--B非極性非極性弱高非極性弱低極住非極性弱履低極住極性強強高可能發(fā)生溶劑效應(yīng)的情形:出峰時刻早；保留弱；進樣量大。用流動相溶解樣品能夠取得專門好的峰形當溶解樣品的溶劑不同于流動相時，樣品溶劑與流動相發(fā)生混合，樣品溶劑被沖稀。若是進樣溶劑之強度高于流動相，樣品在剎時會表現(xiàn)為在較強溶劑中，并以較快速度通過色譜柱。表此刻色譜圖上確實是：色譜峰的保留時刻縮短。'當進樣溶劑與流動相混合時，一部份分子會先與流動相混合，致使這些分子通過色譜柱的速度發(fā)生轉(zhuǎn)變，使峰形扭曲，發(fā)生變形。洗脫較早的色譜峰峰變形要比洗脫晚的色譜峰嚴峻。解決進樣溶劑問題的關(guān)鍵是使進樣體積足夠小，如此稀釋進程會超級快；或利用比流動相弱的溶劑溶解樣品。較弱的溶劑會使樣品在色譜柱上發(fā)生濃縮，在某些情形下，色譜峰會比利用較強溶劑時窄一些。因此，在通常情形下，若是溶解樣品的溶劑比流動相強，進樣體積應(yīng)不高于25mL。進樣體積大小與進樣溶劑與流動相之間的不同大小有關(guān)。這一不同很容易憑體會取得：慢慢加大進樣體積，直至發(fā)生峰變形現(xiàn)象。采納比發(fā)生峰變形時小一些的進樣體積即可。問題中發(fā)生的峰變形確實是因為溶解樣品的溶劑甲醇強度遠遠高于流動相，因此取得了變形的、展寬的峰。若是利用水來溶解樣品，溶解樣品的溶劑弱于流動相，峰形會得以改善。在離子對色譜中，咱們建議利用流動相來溶解樣品，以最大程度地降低基線假峰的顯現(xiàn)。樣品溶劑別離為100%乙臘、流動相時峰形分析上圖中，色譜圖上較早洗脫的峰扭曲變形或開叉，與此同時較晚洗脫的峰那么較為尖銳與對稱，這些現(xiàn)象顯示一個比較特殊的起因——樣品溶液的溶劑極可能強于流動相。此種強溶劑效應(yīng)的例子在左圖中可見。此處的樣品溶液的溶劑是100%乙腈（100%的強溶劑），而流動相的組成那么較弱，18%的乙腈與72%的水。第一個峰是開叉的，而且與第二個峰相較，明顯地變寬了。當樣品溶液的溶劑變成流動相時，所有的峰形都改善了，且變得尖銳。見右圖。什么緣故呢？這是因為當樣品進樣時，有可能顯現(xiàn)峰展寬，最正確的樣品溶液組成和體積將會維持在10%乃至更低,在那個例子里，當樣品溶劑與流動相溶劑強度不同時,換句話來講,也確實是樣品未用流動相溶解，因此，有些樣品分子溶解在強溶劑中，并隨強溶劑流過柱子,而有些那么溶解在流動相中，從而致使峰分叉.當樣品與流動相強度相差較小，進樣阻礙也會小，第一個峰可能會寬于第二個峰,而當這種展寬致使必要的分離度降低時,如此情形應(yīng)引發(fā)注意，在左圖中,利用一根短柱，和5gL進樣,這與最正確進樣體積4gL相近,用了極性更強的溶劑致使分離度明顯的降低,從降到（如右圖，分離度為2或更大是評估一個完善方式的一個必要參數(shù)，也是天天方式的驗證參數(shù)，只是一個大體的分離度，任何一個方式或一根柱子都必需知足那個條件，當進樣為一倍時，也確實是10gL時，分離度更一步降低，此方式就不行了。樣品溶劑選擇不妥的解決方式骯址柯pitii揉州丈1WJJ-?!!'■￡4￡畤于我，&比各場，低B她更有到卡群到對孫耳0法」n咎成的暮用好品誑州喬濟亍心打：貧交符由sa制走陣秘檢備流明枉!?.:：■-li.代和作均*品怵混作組企支化忌#本梧與F：?」*；」霸土底應(yīng)導(dǎo))/n.芝糧合世帥波動相b,他拌企遣構(gòu)海好1A初和誠初■相苗豪一走夏或出不為勺身.出不少或H性生世食卷波動+n理血■.■：--■.?.?：_.m、』'l.i?:;--1111‘I.?:沌捫節(jié)/■-.-.$沌't%"亭 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￡樣品溶劑最好具有哪些特點比較好?筆酒純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱吊穩(wěn)由于高效液相靈檄度高，對疝部相消削的純度箜求也高*不純的溶劑會引恒基線不?穩(wěn)，或產(chǎn)生齊偽峰”)。(2)溶劑時于荷測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性，gpfe夠曲溶解能力溶劑要與檢測器匹配對于UVTis,所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收或I吸收很小化學(xué)穩(wěn)定性好不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑低粘度，沸點適中減小溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力，降低柱壓，利于提高柱致，常用的低粘度溶劑有內(nèi)-酮、乙醇、乙臘等；粘度過低I的溶劑也不宜采用，如戊烷、乙醒等，易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡,影響分離HPLC溶劑的要求溶劑的極性要與待測樣品相匹配，若是溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但阻礙純化分離，且會使柱子惡化。實戰(zhàn)問答Q&A，絕對接地氣!里面的溶劑效應(yīng)是如何產(chǎn)生的，該如何幸免?如何判定分叉的峰是不是由溶劑效應(yīng)造成，第一確實是通過HPLC儀器比對一下兩個劈叉峰的紫外吸收波譜，看看他們是不是能完全一樣的pv特點吸收，第二將進樣體積調(diào)劑到m看看，峰是不是好轉(zhuǎn)，若是知足上面兩個條件幾乎就能夠夠確信是100%的溶劑效應(yīng)。產(chǎn)生緣故1，樣品溶液的溶劑極可能強于流動相。例如樣品溶液的溶劑是100%乙腈（100%的強溶劑），而流動相的組成那么較弱，18%的乙腈與72%的水產(chǎn)生緣故2,確實是進樣量比較大，產(chǎn)生緣故3,樣品的pH值與HPLC流動相pH差異，比如酸性流動相體系，樣品pH偏堿性（pH=10），這種情形下也很有可能發(fā)生其實上面三個緣故歸結(jié)起來確實是一個緣故，那確實是樣品的溶劑與流動相存在一些不一樣，當樣品進入流動相的時候，由于這種龐大的不同，一部份樣品溶解進入了流動相，一部份還留在進樣的溶劑里面，因此在HPLC上顯現(xiàn)了保留的不同，因此要解決那個問題的最正確方案確實是，利用流動相的起始梯度溶解樣品，若是由于溶解度的問題，不能不改用其余的溶劑，那就只能降低進樣體積來解決，比如5pl，1pL。高效液相做專屬性實驗時，溶劑峰和目標峰出峰時刻一樣如何辦?分離的是氨基酸類物質(zhì)，不是離子型化合物，流動相用的甲醇和水，也是用流動相配的溶劑，可是比例有少量不同，單進溶劑時確實有溶劑峰，用流動相配的樣品能夠和溶劑峰分開，我在做腸灌流實驗，可是當樣品進入動物體內(nèi)灌流后，進樣后就分不開了，我想把樣品的出峰時刻延長一些，以為能分開，可是不明白怎么調(diào)整，實在沒方法?；卮穑簡栴}1：你用的稀釋劑是純的有機相嗎?稀釋劑中有機相的比例一樣盡可能與流動相一致，以減小溶劑效應(yīng).若是改變稀釋劑仍不能改善，那么說明你的色譜條件不適合,檢測組分在色譜柱中幾乎無保留.若是你的化合物是離子型的，一樣需要利用緩沖鹽,緩沖液pH值應(yīng)在化合物pKa值正負2之外，以增強組分在色譜系統(tǒng)中的保留.若是不是離子型化合物，那么減少有機相較例,以增加組分保留時刻，躲開溶劑峰.問題2：氨基酸類物質(zhì)是兩性化合物，出峰時刻跟pH值有專門大關(guān)系，樣品通過動物體內(nèi)后，pH值確信是發(fā)生了轉(zhuǎn)變的，樣品的預(yù)處置就很重要了（那個你要請教其他高人，我沒做過生物方面的藥物分析）。若是你只是想單獨延遲樣品出峰時刻，能夠試著減少有機相較例，看能不能達到成效，若是不行，可能仍是要用緩沖體系。醋酸曲安耐德用高效液相色譜測定，流動相為甲醇-水（60:40），ODSC18柱，紫外檢測波長240nm，柱溫30度。以前樣品用甲醇溶解后直接進樣，色譜峰各項參數(shù)正常。此刻用甲醇溶解后進樣，色譜峰變寬，必需用流動相溶解才能正常。儀器與色譜柱未改換，溶解樣品的甲醇換成默克色譜純甲醇也仍是如此！什么緣故？另外我需要測定的另一個中藥中黃苓苷也顯現(xiàn)了這種現(xiàn)象？我此刻該如何辦？解答：溶劑效應(yīng)是確信的。溶劑效應(yīng)的原理其實很簡單：確實是溶質(zhì)的極性和流動相的極性不匹配，致使溶質(zhì)被流動相包裹或部份包裹，不能充分分散并充分與C18互換，因此才致使峰展寬。你的醋酸曲安耐德極性并非是很強。我?guī)湍悴榱怂膌ogP,沒查到，但依照我的體會，并依照其結(jié)構(gòu)式我可能推算了一下，應(yīng)該在2左右，應(yīng)該屬于中等偏弱極性的化合物（C26）。因此其在60：40如此含水流動相匹配度確信不行。以前你做的沒有問題，一個緣故是上面列位所說的，溶解樣品的甲醇可能含水量略微高一些，比如大約含水2%（只是猜想哈），可能就可不能顯現(xiàn)溶劑效應(yīng)，而這次用的甲醇含水量很低。另一個可能的緣故我感覺可能是原先柱子相對照較新，用了一段時刻后，柱頭可能有塌陷，致使溶劑效應(yīng)加重（這種可能性更大一點）。這些都是猜想的，不然很難說明以前專門好，此刻不行的緣故。無非確實是這兩條。至于黃苓苷，我也查了其結(jié)構(gòu)式，極性跟醋酸曲安耐德也差不多，能略微強一點。一樣的問題。解決方法：你能夠嘗試用90：10的溶液溶解樣品再試一下，若是變好了，那就說明溶劑效應(yīng)很明顯。只能改變?nèi)軇悠返娜軇┝?，沒別的方法。關(guān)于排除溶劑效應(yīng)，在咱們利用的甲醇當中，其實并非是單單甲醇，還有其他成份，只是這些個成份，在紫外下不干擾測定罷了做過度離的朋友都明白，不同廠家，不同批次間甲醇的洗脫能力，體會證明確實不盡相同的，專門是關(guān)于對極性條件相對苛刻的分離情形。因此，問題可能在于甲醇上，有條件的話，是不是能夠測一下那個批次甲醇的水分呢。固然，溶劑效應(yīng)還有其他方面的阻礙，比如系統(tǒng)，色譜柱…今天我做葛根素的測定，葛根素是用30%乙醇溶解，流動相是甲醇-水（25:75），半年前的色譜峰對稱系數(shù)為，此刻變成了，峰明顯變胖！什么緣故此刻只要不是用流動相溶解，就會顯現(xiàn)峰變形的情形呢？與我的儀器是不是有關(guān)系，仍是溶劑（比如甲醇）有關(guān)呢？一、 葛根素和黃苓苷包括醋酸曲安耐德他們都是結(jié)構(gòu)超級相似的三個化合物，因此一個出問題，所有的都會有相似的問題的。我感覺問題最大的可能仍是在色譜柱的柱頭。溶劑效應(yīng)現(xiàn)象，柱子越細，進樣量越大，目標化合物和流動相極性匹配度不同越大，問題越明顯。若是你用的是超高壓的話，會更明顯。我在做HPLC/MS/MS的時候，用的都是的柱子，大體上都要用流動相來溶解樣品，不然絕大多數(shù)情形下都有溶劑效應(yīng)。你若是用超高壓HPLC這種溶解效應(yīng)會很顯著。這種問題沒別的方法，只有改用流動相溶解。二、 你上面提到的葛根素的測定要做一個對如實驗：一個是純?nèi)軇┤芙獾?，一個是流動相溶解的。若是二者有區(qū)別，那說明是溶劑效應(yīng)問題，建議先用異丙醇清洗系統(tǒng)，若是溶劑效應(yīng)還在，建議再換成20微升進樣定量環(huán)，每次進10微升。滿環(huán)進樣仍是有很明顯的溶劑效應(yīng)，工程師也沒有跟好的方法。若是二者沒有區(qū)別，那就不是溶劑效應(yīng)問題。你半年前做的好好的，不代表這根柱子此刻就必需必然得好