四種櫟屬遺傳多樣性的ssr分析

四種櫟屬遺傳多樣性的ssr分析

隨著過(guò)程技術(shù)的發(fā)展，植物est序列的數(shù)量日益增加。通過(guò)est序列開(kāi)發(fā)神圣斯瑞克林堡的分子標(biāo)記成為一種經(jīng)濟(jì)有效的方法（徐玉林等，2012）。許多木本植物,如茶樹(shù)(金基強(qiáng)等,2006)、桉樹(shù)(李淑嫻等,2010)、檉柳(張如華等,2011)、白樺(王艷敏等,2008)、橡膠樹(shù)(安澤偉等,2009;Fengetal.,2009)、核桃(朱艷等,2009)、荔枝(孫清明等,2011)、銀杏(樊洪泓等,2009)、中國(guó)板栗(向闈等,2010)、楊樹(shù)(LiandYin,2007)等的EST-SSR信息已有所報(bào)道,通常報(bào)道的EST-SSR的信息包括EST-SSR在EST中的分布頻率、大小、引物開(kāi)發(fā)以及通用性檢測(cè)等。櫟屬(Quercus)屬于殼斗科(Fagaceae),為殼斗科中的第一大屬,該屬不僅種類最多,而且分布最廣。全世界約有三百余種櫟屬植物分布,中國(guó)分布有六十余種。微衛(wèi)星標(biāo)記是在櫟屬中被廣泛運(yùn)用的一種分子標(biāo)記,微衛(wèi)星在櫟屬群體的遺傳多樣性水平、群體遺傳分化與結(jié)構(gòu)、群體間的基因流及交配系統(tǒng)等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。然而目前用于櫟屬分子研究的微衛(wèi)星主要來(lái)自Kampfer等(1998)從歐洲栓皮櫟(Quercusrobur)開(kāi)發(fā)的32對(duì)(GA)n重復(fù)基元的SSR引物,Steinkellner等(1997)從無(wú)?；?Quercuspe-traea)中開(kāi)發(fā)的17對(duì)(GA/CT)n重復(fù)基元SSR;Dow等(1995)從大果櫟(Quercusmacrocarpa)中開(kāi)發(fā)的3對(duì)(GA/CT)n重復(fù)基元的SSR;DowandAshlely(1996)從大果櫟中開(kāi)發(fā)的1對(duì)引物。因此,櫟屬中所使用的SSR引物至今為止仍然很少,需要更多的SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)進(jìn)行補(bǔ)充,以增加位點(diǎn)數(shù),為櫟屬的遺傳多樣性研究服務(wù)。1結(jié)果與分析1.1蒙古櫟的est序列對(duì)蒙古櫟、無(wú)?；怠⑾臋?、歐洲栓皮櫟的EST序列長(zhǎng)度及GC含量進(jìn)行分析如表1和圖1所示。其中,夏櫟的EST序列最多,有81671條,總長(zhǎng)度達(dá)到47031157bp,而蒙古櫟的EST序列有3385條,總長(zhǎng)度1855072bp。四種櫟類的平均EST序列的長(zhǎng)度均為500bp左右,GC含量均為40%左右。1.2電子法上ssr的變化由表2可見(jiàn),蒙古櫟、無(wú)梗花櫟、夏櫟和歐洲栓皮櫟的EST序列中絕大部分是一個(gè)EST序列中含有一個(gè)SSR,在蒙古櫟、無(wú)?；怠⑾臋岛蜌W洲栓皮櫟中分別有423條、3978條、6372條和511條EST,每條EST序列都是只含有一個(gè)SSR,每條EST序列含有兩個(gè)SSR的情況在四種櫟類中出現(xiàn)也較多;最多的甚至可以達(dá)到1條EST序列中含有8個(gè)SSR,在夏櫟中就出現(xiàn)了這樣的情況。1.3ssr的長(zhǎng)度和分布根據(jù)統(tǒng)計(jì),由表3,在蒙古櫟、無(wú)?；怠⑾臋岛蜌W洲栓皮櫟EST序列中分別有578個(gè)、5116個(gè)、7994個(gè)、589個(gè)SSR存在。據(jù)四個(gè)櫟樹(shù)用于查找這些SSR的EST序列總長(zhǎng)度,蒙古櫟中3209.46bp有一個(gè)SSR、無(wú)?；抵忻?160.36bp有一個(gè)SSR、夏櫟中每5883.30bp有一個(gè)SSR、歐洲栓皮櫟中每6129.12bp有一個(gè)SSR。且在四種櫟類中均是二基元、三基元和六基元的SSR遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于四基元和五基元的SSR。在蒙古櫟中SSR的平均長(zhǎng)度從19.25bp到25.95bp,平均21.65bp,無(wú)?；档腟SR平均長(zhǎng)度為21.1bp、夏櫟SSR的長(zhǎng)度為20.66bp,歐洲栓皮櫟SSR的平均長(zhǎng)度為20.65bp。四種櫟類的SSR長(zhǎng)度差別不大。由圖1可見(jiàn),不同重復(fù)基元的SSR在四種櫟類的分布頻率,有著非常明顯且一致的分布特征。在四種櫟類中均是二基元、三基元和六基元的SSR最多,這三種類型的SSR在四種櫟類中都達(dá)到了25%以上D,且在四種櫟類中均是二基元的SSR的分布頻率>六基元SSR的分布頻率>三基元SSR的分布頻率。而四基元和五基元的SSR在四種櫟中的分布均小于0.05%。1.4兩基元ssr的頻率分布如表4所示,不同基元的SSR在四種櫟類中出現(xiàn)的頻率具有很大的差異。由于在四種櫟類中,各種類型的基元出現(xiàn)頻率不一,有的基元的出現(xiàn)頻率甚至只有千分之一,為尋找普遍規(guī)律及分析的便利,取出現(xiàn)頻率大于1%的基元類型用于最終的結(jié)果分析。結(jié)果表明:在蒙古櫟中,二基元的SSR中:CT基元出現(xiàn)的頻率最高,達(dá)到了15.22%,TC基元其次,出現(xiàn)頻率為9.34%,AG基元出現(xiàn)的頻率也較高,為7.27%。而其它的二基元SSR如AT、GA、TA的出現(xiàn)頻率則很低,只是略高于1%;三基元的SSR中:CTT和CAA基元的出現(xiàn)頻率達(dá)到了2%以上,分別為2.77%和2.42%,GAA和AGA基元的出現(xiàn)頻率分布達(dá)到了1.73%、1.56%,而其余的基元如ACA、ATA、GAG、GAT、TAT、TCT、CTC基元均未達(dá)到1.5%;六基元的SSR中:CTCTCA出現(xiàn)頻率最高,為1.90%,AACCCT的出現(xiàn)頻率也達(dá)到了1.21%,其它高于1%的六基元SSR中AAGCCA和CACAAC的出現(xiàn)頻率均為1.04%。在無(wú)?；抵?二基元SSR出現(xiàn)的頻率與蒙古櫟類似,大于1%的二基元SSR均是AG、CT、TC、GA、AT、TA基元,并且也是AG、CT、TC基元的分布頻率最高,分別為8.01%、7.76%、7.58%、但是略不同的是在無(wú)?；抵械姆植碱l率也較高,達(dá)到了3.62%和2.58%,分布頻率最低的二基元SSR為基元,頻率為1.54%;三基元的SSR中:CTT、GAA、AAG的分布頻率最高,分別為2.44%、2.93%、1.99%,GAG基元也達(dá)到了1.52%,而其它的三基元SSR如CAA、GAT、TCT、TTC等均略高于1%。在無(wú)?；抵兴幕⑽寤约傲腟SR的分布頻率均沒(méi)有達(dá)到1%的。在夏櫟和歐洲栓皮櫟二基元SSR的分布頻率中出現(xiàn)了跟蒙古櫟和無(wú)梗花櫟類似的情況,即均是AG、CT、TC、GA、AT、TA基元,并且也是AG、CT、TC基元的分布頻率最高。而略不同的是各基元的頻率不相同,在夏櫟和歐洲栓皮櫟中AG、CT、TC的分布頻率幅度為,夏櫟7.57%、7.87%、8.48%;歐洲栓皮櫟7.30%、6.45%、9.34%。歐洲栓皮櫟中GA的分布頻率也很高,達(dá)到了9.51%。夏櫟和歐洲栓皮櫟的三基元SSR中分布頻率最高的基元分別是GAA和CAA數(shù)值為3.75%和2.21%。夏櫟中六基元SSR有三種類型AACCCT、TAGGGT、TG-GAGG分布頻率均略高于1%。歐洲栓皮櫟中六基元的SSR有四種類型,分別為AACCCT、AAGATG、TCTTCA、TAGGGT,其中,AAGATG、TCTTCA的分布頻率達(dá)到了2.72%和3.40%。2電子確定度分析從NCBI下載了蒙古櫟、無(wú)?；?、夏櫟、歐洲栓皮櫟的EST序列共計(jì)149976條,尋找其中的SSR,分析四種櫟類EST-SSR的特點(diǎn)。在蒙古櫟、無(wú)?；怠⑾臋?、歐洲栓皮櫟EST序列中分別有578、5116、7994、589個(gè)SSR存在,分別占四種櫟類EST的17.07%、8.78%、9.78%、17.40%,四種櫟類的SSR在EST中的平均分布頻率為13.25%。這一頻率略高于白樺EST序列中SSR出現(xiàn)的頻率(12.05%)(王艷敏等,2008)。但是這個(gè)數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甘蔗的2.9%(Cordeiroetal.,2001)、水稻的4.7%(Kantetyetal.,2002)、普通小麥的5.4%(Guptaetal.,2003)。這種差異可能是由于物種之間本質(zhì)存在分布頻率差異造成的,不同的搜索軟件,以及對(duì)搜索條件界定(SSR長(zhǎng)度,基元重復(fù)次數(shù)等)也可能造成這種差異。EST-SSR在各種植物中分布的頻率差異很大,從每2kb到20kb左右都有可能。從SSR在EST上的分布頻率來(lái)看,蒙古櫟中3209.46bp有一個(gè)SSR,無(wú)梗花櫟中每6160.36bp有一個(gè)SSR,夏櫟中每5883.30bp有一個(gè)SSR,歐洲栓皮櫟中每6129.12bp有一個(gè)SSR。在草莓中的出現(xiàn)頻率為平均每5.52kb1個(gè)SSR(王靜等,2011),與夏櫟的出現(xiàn)頻率一致。蒙古櫟中,SSR的平均長(zhǎng)度21.65bp,無(wú)?；礢SR的平均長(zhǎng)度為21.1bp,夏櫟SSR的平均長(zhǎng)度為20.66bp,歐洲栓皮櫟SSR的平均長(zhǎng)度為20.65bp。四種櫟類中不同基元SSR的分布頻率有極大的相似性,四種櫟類中均是二基元、三基元和六基元的SSR分布頻率最高,均達(dá)到了20%以上。而四基元和五基元的SSR在四個(gè)種類中的分布不到0.05%。二核苷酸是在植物中分布最高的重復(fù)序列(Cardleetal.,2000)。四種櫟類中也是二基元的SSR分布最高。據(jù)報(bào)道,三基元的SSR在甘蔗以及普通小麥中的分布也較高,分別為90%以上和67.12%(Cordeiroetal.,2001;Guptaetal.,2003),本研究中三基元的SSR的分布頻率僅有20%左右。而六核苷酸的分布頻率達(dá)到20%以上的報(bào)道很少見(jiàn)。相似性還體現(xiàn)在,二基元的SSR中大于1%的SSR均是AG、CT、TC、GA、AT、TA基元,并且在蒙古櫟、無(wú)?；?、夏櫟A(chǔ)G、CT、TC基元的分布頻率最高,而在歐洲栓皮櫟中是TC、GA、AG的分布頻率最高。而GA是蒙古櫟、無(wú)梗花櫟、夏櫟中分布頻率居第二的二基元SSR,它的分布頻率在幾種櫟類之間差異性很大,在蒙古櫟、無(wú)梗花櫟、夏櫟、歐洲栓皮櫟中GA的分布頻率分別為1.90%、3.62%、3.62%。三基元的SSR中,含CAA、GAA、TCT、CTT的SSR在四種櫟類中都存在。六基元的SSR在四種櫟類中出現(xiàn)的類型均較少,為0~4種。GA重復(fù)是大多數(shù)植物二基元的SSR出現(xiàn)頻率最高的核苷酸。歐洲栓皮櫟的二基元SSR中也是GA重復(fù)最多,而蒙古櫟中是CT重復(fù)最多,無(wú)?；岛拖臋祫t是AG和TC基元的SSR最多。在獼猴桃(Fraseretal.,2004)中頻率最高的二核苷酸重復(fù)為CT與蒙古櫟一致。而白樺的研究表明TC是分布頻率最高的二基元SSR(王艷敏等,2008),與夏櫟一致。不同三基元的SSR的分布頻率在不同物種中差異較大。在白菜和擬南芥中GAA較多,而在水稻、大麥、高粱、玉米中CCG則是主要三核苷酸重復(fù)(Gaoetal.,2003),Kantety(2002)報(bào)道小麥三核苷酸SSR中占優(yōu)勢(shì)的類型是AAC。四種櫟類的三基元SSR中分布頻率最高的分別是,蒙古櫟CTT基元,無(wú)?；岛拖臋档腉AA基元,歐洲栓皮櫟