第二章核酸化學

第二章核酸化學第1頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的概念和重要性核酸的組成成分DNA的結(jié)構DNA和基因組RNA的結(jié)構和功能核酸的性質(zhì)核酸的序列測定第2頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)核酸的概念和重要性第3頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月

1868年，瑞士的內(nèi)科醫(yī)生FriedrichMiescher從外科醫(yī)院包扎傷口的繃帶上的膿細胞核中提取到一種富含磷元素的酸性化合物，將其稱為核素(nuclein)；后來他又從鮭魚精子中分離出類似的物質(zhì)，并指出它是由一種堿性蛋白質(zhì)與一種酸性物質(zhì)組成的，此酸性物質(zhì)即是現(xiàn)在所知的核酸(nucleicacid)。第4頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月

1944年,OswaldAvery,ColinMacleod和MaclynMcCarty發(fā)現(xiàn)，一種有夾膜、表面光滑、具致病性的肺炎球菌中提取的核酸DNA(deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸)，可使另一種無夾膜，表面粗糙、不具致病性的肺炎球菌的遺傳性狀發(fā)生改變，轉(zhuǎn)變?yōu)橛袏A膜，具有致病性的肺炎球菌，且轉(zhuǎn)化率與DNA純度呈正相關，若將DNA預先用DNA酶降解，轉(zhuǎn)化就不發(fā)生。該項實驗徹底糾正了蛋白質(zhì)攜帶遺傳信息這一錯誤認識，確立了核酸是遺傳物質(zhì)的重要地位；第6頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA遺傳作用的進一步肯定來自AlfredHershey和MarthaChase對一個感染大腸桿菌的病毒的研究。即用放謝性同位素32P標記噬菌體DNA，35S標記其蛋白質(zhì)外殼，再用標記的噬菌體去感染培養(yǎng)的大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)進入細菌體內(nèi)，使細菌生長、繁殖發(fā)生變化的是32P標記的DNA，而不是35S標記的蛋白質(zhì)，并且新繁殖生成的噬菌體不含35S，只含32P。第8頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分為兩大類.脫氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid核酸的分類第11頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）：遺傳信息的貯存和攜帶者，生物的主要遺傳物質(zhì)。在真核細胞中，DNA主要集中在細胞核內(nèi)，線粒體和葉綠體中均有各自的DNA。原核細胞沒有明顯的細胞核結(jié)構，DNA存在于稱為類核的結(jié)構區(qū)。每個原核細胞只有一個染色體，每個染色體含一個雙鏈環(huán)狀DNA。核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）：主要參與遺傳信息的傳遞和表達過程，細胞內(nèi)的RNA主要存在于細胞質(zhì)中，少量存在于細胞核中，病毒中RNA本身就是遺傳信息的儲存者。另外在植物中還發(fā)現(xiàn)了一類比病毒還小得多的侵染性致病因子稱為類病毒，它是不含蛋白質(zhì)的游離的RNA分子，還發(fā)現(xiàn)有些RNA具生物催化作用（ribozyme）。第12頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月分布含量

DNA含量恒定，RNA含量與細胞生長狀態(tài)有關。第14頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)、核酸的組成成分核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤堿purinebase

或嘧啶堿pyrimidinebase（堿基base）核糖ribose

或脫氧核糖deoxyribose

（戊糖amylsugar）第15頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脫氧核糖O核糖+H+糠醛甲基間苯二酚FeCl3綠色產(chǎn)物Δ脫氧核糖+H+

Δω-羥基-γ-酮戊醛二苯胺藍色產(chǎn)物RNA和DNA定性、定量測定第16頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤guanine（G）第17頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）第18頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式第19頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHH9腺嘌呤腺苷NH2糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵第20頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）第21頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）核苷酸OO（N=A、G、C、U、T）HH(O)H1′2′NOHCH2HH5′4′3′PO-OOO-核糖磷酸堿基第22頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月核苷酸是核苷的磷酸酯。作為DNA或RNA結(jié)構單元的核苷酸分別是5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷。第23頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸苷PO--O—O‖胸苷-5′-磷酸AMPOPO--O—O‖~ADPATPP

O--O—O‖~ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)第24頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月ATP的性質(zhì)ATP分子的最顯著特點是含有兩個高能磷酸鍵。ATP水解時,可以釋放出大量自由能。ATP是生物體內(nèi)最重要的能量轉(zhuǎn)換中間體。ATP水解釋放出來的能量用于推動生物體內(nèi)各種需能的生化反應。ATP也是一種很好的磷?；瘎Ａ柞；磻牡孜锟梢允瞧胀ǖ挠袡C分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有較高的能量（活化分子），是許多生物化學反應的激活步驟。第25頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA和DNA合成的直接原料。在體內(nèi)能量代謝中的作用：ATP——能量“貨幣”UTP——參加糖的互相轉(zhuǎn)化與合成CTP——參加磷脂的合成GTP——參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成第26頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月cAMP(3’,5’-環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸)和cGMP(3’,5’-環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作為細胞之間傳遞信息的信使。第二信使——cAMP第27頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）核苷酸的連接方式核酸的一級結(jié)構多聚核苷酸是由四種不同的核苷酸單元按特定的順序組合而成的線性結(jié)構聚合物，因此，它具有一定的核苷酸順序，即堿基順序。核酸的堿基順序是核酸的一級結(jié)構。第28頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月OHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHOHO-OO—CH2GO=P—O-3′5′OHOO—CH2OHOHAO=P—OO-3′5′核苷酸之間的共價鍵3

-5

磷酸二酯鍵第29頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月在多聚核苷酸中，兩個核苷酸之間形成的磷酸二酯鍵通常稱為5′—3′磷酸二酯鍵。多聚核苷酸鏈一端的C5′帶有一個自由磷酸基，稱為5′-磷酸端（常用5’-P表示）；另一端C3’帶有自由的羥基，稱為3′-羥基端（常用3’-OH表示）。多聚核苷酸鏈具有方向性，當表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。第30頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月5′3′結(jié)構式5′3′

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pOH3′ACTG1′線條式5′

ACTGCATAGCTCGA3′字母式核酸一級結(jié)構的表示法第31頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月堿基（嘧啶、嘌呤）核糖/脫氧核糖

核苷酸3′-5′磷酸二酯鍵核酸糖苷鍵核苷＋磷酸5′磷酯鍵RNA：AMP、GMP、CMP、UMPDNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMP第32頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、DNA一級結(jié)構

二、DNA的二級結(jié)構三、DNA的三級結(jié)構

第三節(jié)DNA的結(jié)構第33頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月定義：

DNA分子中各脫氧核苷酸之間的連接方式（3′-5′磷酸二酯鍵）和排列順序叫做DNA的一級結(jié)構，簡稱為堿基序列。一級結(jié)構的走向的規(guī)定為5′→3′。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列順序，因此攜帶有不同的遺傳信息。一級結(jié)構的表示法：結(jié)構式，線條式，字母式一、DNA的一級結(jié)構第34頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月5′3′結(jié)構式5′3′

p

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pOH3′ACTG1′線條式5′

ACTGCATAGCTCGA3′字母式DNA一級結(jié)構的表示法第35頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月1DNA的雙螺旋結(jié)構(Watson-Crick模型)2雙螺旋結(jié)構模型的主要依據(jù)3DNA雙螺旋結(jié)構特征及意義4DNA雙螺旋的多態(tài)性二、DNA的二級結(jié)構第36頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月1DNA的雙螺旋結(jié)構(Watson-Crick模型)第37頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月

2雙螺旋結(jié)構模型的主要依據(jù)

（1）Wilkins和Franklin發(fā)現(xiàn)不同來源的DNA纖維具有相似的X射線衍射圖譜。第38頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月1950年，Chargaff首先注意到DNA堿基組成的某些規(guī)律性，在總結(jié)出DNA堿基組成的規(guī)律：A、腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，即A=T。B、鳥嘌呤和胞嘧啶的摩爾數(shù)也相等，即G=C。C、嘌呤的總數(shù)等于嘧啶的總數(shù)，即A+G=C+T。2、DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則第39頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）電位滴定行為證明嘌呤與嘧啶的可解離基團由氫鍵連接。

Pauling和Corey發(fā)現(xiàn)A與T生成2個氫鍵、C與G生成3個氫鍵第40頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月3、DNA的雙螺旋模型特點A、兩條反向平行的多聚核苷酸鏈沿一個假設的中心軸右旋相互盤繞而形成（右手螺旋），螺旋表面有一條大溝和一條小溝。5′3′第41頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月B、磷酸和脫氧核糖單位作為不變的骨架組成位于外側(cè)，作為可變成分的堿基位于內(nèi)側(cè)，鏈間堿基按A–T（兩個氫鍵），G-C配對（三個氫鍵）。第42頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月C、螺旋直徑2nm，相鄰堿基平面垂直距離0.34nm，螺旋結(jié)構每隔10個堿基對（basepair,bp）重復一次，間隔為3.4nm3.4?34?第43頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月1、氫鍵2、堿基堆集力3、磷酸基上負電荷被胞內(nèi)組蛋白或正離子中和4、堿基處于疏水環(huán)境中穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構的因素第45頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA雙螺旋結(jié)構模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，確認了堿基配對原則，這是DNA復制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎，亦是遺傳信息傳遞和表達的分子基礎。該模型的提出，是本世紀生命科學的重大突破之一，它奠定了生物化學和分子生物學乃至整個生命科學飛速發(fā)展的基石。3、DNA的雙螺旋結(jié)構的意義第46頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月4,DNA雙螺旋的不同構象第47頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第48頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第49頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月ABZ外型粗短適中細長螺旋方向右手右手左手螺旋直徑2.55nm2.37nm1.84nm堿基直升0.23nm0.34nm0.38nm每圈堿基數(shù)111012堿基傾角19000

90大溝很窄很深很寬較深平坦小溝很寬、淺窄、深較窄很深Z-DNAA-DNAB-DNA三種DNA雙螺旋構象比較第50頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月三、DNA的三級結(jié)構1、什么是DNA的三級結(jié)構？（定義）2、超螺旋DNA（SupercoiledDNA）第51頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的三級結(jié)構，是指雙螺旋DNA分子通過扭曲和折疊所形成的特定構象，包括不同二級結(jié)構單元間的相互作用、單鏈和二級結(jié)構單元間的相互作用以及DNA的拓撲特征。DNA三級結(jié)構的定義Back第52頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月超螺旋螺旋超螺旋第53頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月L=25,T=25,W=0松弛環(huán)形1152010523L=23,T=23,W=0解鏈環(huán)形15101520231510152025L=23,T=25,W=–2負超螺旋121482316131510152023右手旋轉(zhuǎn)擰松兩匝后的線形DNADNA超螺旋的形成第54頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月L為連環(huán)數(shù)（linkingnumber）：DNA雙螺旋中一條鏈以右手螺旋與另一條鏈纏繞的次數(shù)。T指DNA分子中的螺旋數(shù)（twistingnumber）W為超螺旋數(shù)或纏繞數(shù)（writhingnumber）超螺旋的拓撲學公式：L=T+W超螺旋狀態(tài)的定量描述第55頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA超螺旋結(jié)構形成的意義使DNA形成高度致密狀態(tài)從而得以裝入核中；推動DNA結(jié)構的轉(zhuǎn)化以滿足功能上的需要。如負超螺旋分子所受張力會引起互補鏈分開導致局部變性，利于復制和轉(zhuǎn)錄。Back第56頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體包裝的結(jié)構模型多級螺旋模型壓縮倍數(shù)76405（8400）

DNA→核小體→螺線管→超螺線管→染色單體2nm10nm30(10)nm400nm2~10μm

一級包裝二級包裝三級包裝四級包裝

第57頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第58頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月四、DNA與基因組織DNATranscription

RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能單位。結(jié)構基因調(diào)節(jié)基因基因組（一）DNA與基因第59頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）原核生物基因組的特點1.DNA大部分為結(jié)構基因，每個基因出現(xiàn)頻率低。2.功能相關基因串聯(lián)在一起，并轉(zhuǎn)錄在同一mRNA中（多順反子）。3.有基因重疊現(xiàn)象。ABCDEFG第60頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）真核生物基因組的特點1.重復序列單拷貝序列：在整個DNA中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，主要為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構基因。中度重復序列：在DNA中可重復幾十次到幾千次。高度重復序列：可重復幾百萬次高度重復序列一般富含A-T或G-C，富含A-T的在密度梯度離心時在離心管中形成的區(qū)帶比主體DNA更靠近管口；富含G-C的更靠近管底，稱為衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）富含A-T富含G-C主體DNA第61頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月2.有斷裂基因mRNA1872bp內(nèi)含子（intron)：基因中不為多肽編碼，不在mRNA中出現(xiàn)。ABCDEG7700bpF外顯子（exons）：為多肽編碼的基因片段。：由于基因中內(nèi)含子的存在。例外：組蛋白基因(histongene)和干擾素基因(interferongene)沒有內(nèi)含子。transcription第62頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、RNA一級結(jié)構和類別二、tRNA的分子結(jié)構三、rRNA的分子結(jié)構四、mRNA的分子結(jié)構第五節(jié)RNA的分子結(jié)構Back第63頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月

RNA分子中各核苷之間的連接方式（3′-5′磷酸二酯鍵）和排列順序叫做RNA的一級結(jié)構OHOHOH5′3′

RNA與DNA的差異

DNARNA糖脫氧核糖核糖堿基AGCTAGCU

不含稀有堿基含稀有堿基RNA的一級結(jié)構Back第64頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月1、信使RNA

（messengerRNA，mRNA）：在蛋白質(zhì)合成中起模板作用；2、核糖體RNA

（ribosomalRNA，rRNA）：與蛋白質(zhì)結(jié)合構成核糖體（ribosome）,核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所；3、轉(zhuǎn)移RNA

（transferRNA，tRNA）：在蛋白質(zhì)合成時起著攜帶活化氨基酸的作用。RNA的類別Back第65頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月二級結(jié)構特征：單鏈三葉草葉形四臂四環(huán)一、tRNA的結(jié)構三級結(jié)構特征：在二級結(jié)構基礎上進一步折疊扭曲形成倒L型Back第66頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月D環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TψC環(huán)CCAAla3′5′酵母tRNAAla的二級結(jié)構Back第67頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月tRNA的三級結(jié)構Back第68頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月二、rRNA占細胞RNA總量的80%，rRNA（60%）與蛋白質(zhì)（40%）共同組成核糖體。原核生物

真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA70S（30S、50S）16S、5S、23S80S（40S、60S）18S、5S、5.8S、28S

第69頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月特征：單鏈，螺旋化程度較tRNA低與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能5sRNA的二級結(jié)構

rRNA的分子結(jié)構Back第70頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月三、mRNA與hnRNAmRNA約占細胞RNA總量的3－5%，是蛋白質(zhì)合成的模板。真核生物mRNA的前體在核內(nèi)合成，包括整個基因的內(nèi)含子和外顯子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，形成分子大小極不均勻的hnRNA。第71頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月原核生物mRNA：

先導區(qū)-翻譯區(qū)（多順反子）-末端序列真核生物mRNA：

“帽子”-單順反子-“尾巴”三、mRNA的分子結(jié)構（m7G-5′ppp5′-N-3′p）（PolyA）Back第72頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月5′3′順反子順反子順反子插入順序插入順序先導區(qū)末端順序原核細胞mRNA的結(jié)構特點Back第73頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月AAAAAAA-OH5′

“帽子”PolyA3′

順反子m7G-5′ppp-N-3′p真核細胞mRNA的結(jié)構特點Back第74頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月四、snRNA和asRNAsnRNA主要存于細胞核中，占細胞RNA總量的0.1－1%，與蛋白質(zhì)以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、細胞分裂和分化、協(xié)助細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、構成染色質(zhì)等方面有重要作用。asRNA可通過互補序列與特定的mRNA結(jié)合，抑制mRNA的翻譯，還可抑制DNA的復制和轉(zhuǎn)錄。第75頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月五、RNA的其它功能1981年，Cech發(fā)現(xiàn)RNA的催化活性，提出核酶（ribozyme）。大部分核酶參加RNA的加工和成熟，也有催化C-N鍵的合成。23SrRNA具肽酰轉(zhuǎn)移酶活性。RNA在DNA復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯中均有一定的調(diào)控作用，與某些物質(zhì)的運輸與定位有關。第76頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月六、核酸的性質(zhì)（一）一般理化性質(zhì)1.為兩性電解質(zhì)，通常表現(xiàn)為酸性。2.DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，不溶于有機溶劑。3.DNA溶液的粘度極高，而RNA溶液要小得多。4.RNA能在室溫條件下被稀堿水解而DNA對堿穩(wěn)定。5.利用核糖和脫氧核糖不同的顯色反應鑒定DNA與RNA。第77頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的兩性性質(zhì)與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團（磷酸基）也含有堿性基團（氨基），因而核酸也具有兩性性質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個中等強度的酸，而堿性（氨基）是一個弱堿，所以核酸的等電點比較低。如DNA的等電點為4～4.5，RNA的等電點為2～2.5。RNA的等電點比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通過氫鍵促進了磷酸基上質(zhì)子的解離。DNA沒有這種作用。第78頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月pK1=0.9第一磷酸基pK3=6.2第二磷酸基pK2=3.7含氮環(huán)腺嘌呤核苷酸pK1=0.7第一磷酸基pK3=6.1第二磷酸基pK2=3.7含氮環(huán)烯醇式羥基鳥嘌呤核苷酸pK1=0.8第一磷酸基pK3=6.3第二磷酸基pK2=4.3含氮環(huán)胞嘧啶核苷酸pK1=1.0第一磷酸基pK3=6.4第二磷酸基烯醇式羥基尿嘧啶核苷酸pH離子化程度小牛胸腺DNA的滴定曲線pH核苷酸的解離曲線Back第79頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的水解酸或堿水解

核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH的鄰基參與作用有很大的關系。在RNA水解時，2′-OH首先進攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。Back第80頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖+H+糠醛甲基間苯二酚FeCl3綠色產(chǎn)物Δ脫氧核糖+H+

Δω-羥基-γ-酮戊醛二苯胺藍色產(chǎn)物RNA和DNA定性、定量測定第81頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）核酸的紫外吸收性質(zhì)核酸的堿基具有共扼雙鍵，因而有紫外吸收性質(zhì)，吸收峰在260nm（蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm）。2202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123123天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值第82頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30~40%，當核酸變性或降解時光吸收值顯著增加（增色效應），但核酸復性后，光吸收值又回復到原有水平（減色效應）。變性DNA天然雙鏈DNA-ATGCCGGAATTCCGATTGCA--TACGGCCTTAAGGCTAACGT--ATGCCGGAATTCCGATTGCA--TACGGCCTTAAGGCTAACGT-降解產(chǎn)物An，Tn，Gn，Cn增色效應和減色效應Back第83頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的定量分析及純度鑒定（粗略）1、定量分析：1OD260nm2、純度初步鑒定：A260nm／A280nm50mg/ml雙鏈DNA20mg/ml單鏈寡核苷酸40mg/ml單鏈DNA或RNA=2.0=1.8<1.8RNA純品DNA純品？？？蛋白質(zhì)或酚污染核酸紫外吸收性質(zhì)的應用第84頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）核酸結(jié)構的穩(wěn)定性1.堿基對間的氫鍵；2.堿基堆積力；3.環(huán)境中的正離子。第85頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）核酸的的變性1、變性的概念雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結(jié)構破壞，形成單鏈無規(guī)線團狀，只涉及次級鍵的破壞。增色效應粘度下降、浮力密度增高生物學功能部分或全部喪失核酸降解：磷酸二酯鍵斷裂第86頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA變性是個突變過程，類似結(jié)晶的熔解。將紫外吸收的增加量達到最大增量一半時的溫度稱熔解溫度（Tm）TmTm2、熱變性與Tm第87頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月影響Tm的因素：（1）G-C的相對含量

（G+C）%=（Tm—69.3）×2.44（2）介質(zhì)離子強度低，Tm低。（3）高pH下堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵的能力。（4）變性劑如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。第88頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月變性（加熱）復性（緩慢冷卻）復性：在一定條件下，變性DNA單鏈間堿基重新配對恢復雙螺旋結(jié)構，伴有A260減小（減色效應），DNA的功能恢復。（五）核酸的復性第89頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月

變性核酸的互補鏈在適當條件下重新締合成雙螺旋的過程。（Annealing，退火）？？？影響復性速度的因素：（1）單鏈片段濃度（2）單鏈片段的大小（3）片段內(nèi)重復序列的多少（4）溶液離子強度的大?。?）溶液溫度變化（Tm－25）熱變性：上火影響核酸復性的因素第90頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月5’3’5’3’聚合酶鏈式反應（PCR）DNAPolymeraseChainReaction5’5’3’3’5’3’5’3’變性、退火、延伸（30個循環(huán)）加熱變性加入引物后降溫退火在DNA聚合酶作用下延伸擴增百萬倍第91頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月不同來源的DNA單鏈間或單鏈DNA與RNA之間只要有堿基配對的區(qū)域，在復性時可形成局部雙螺旋區(qū)，稱核酸分子雜交（hybridization）（六）分子雜交第92頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月制備總RNA/DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移至薄膜與同位素標記的特異性探針雜交放射性自顯影對照組空白組實驗組Northern/SouthernBlot基本流程圖第93頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性酶切割轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠吸附有DNA片段的膜DNA分子SouthernBlot圖解瓊脂糖電泳DNA片段X-光片第94頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月NorthernDNA陣列被固定物被標記物探針probemRNAmRNA???探針probeDNA微陣列（DNAMicroArray）cDNA第95頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月七、核酸的序列測定目前多采用Sanger的酶法和Gilbert的化學法OHOH2CHHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤ddATPPPP第96頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA序列分析原理CCGTACGTAA5’3’DNA單鏈模板CTACTAGG5’＊寡核苷酸引物GT3’試管1ddATP1/10用量DNA聚合酶dATPdGTPdTTPdCTPdNTPs混合物dA--GGCdA問題？--GGCACTAdATGT------?續(xù)圖第97頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月3’--CCGTGATACA--5’模板測序引物5’--GGddATP管ddCTP管ddGTP管ddTTP管GGCGGCAGGCACGGCACTGGCACTAGGCACTATGGCACTATGGGCACTATGT讀取序列CACTATGTAGTGATAC模板序列5’端5’端3’端3’端3’--CCGTGATACA--5’模板DNA序列分析原理圖（續(xù)）Back第98頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月——CCGGTAGCAATT——3′5′模板引物——GG—5′3′GGCGGCCGGCCATCCddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAddATPAGGCCATCGGGCCATCGTTGGddGTPGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTTddTTPCCATCGTTGA5′3′