利用極譜波法測(cè)定血清中的蛋白質(zhì)

利用極譜波法測(cè)定血清中的蛋白質(zhì)

提前完成后，人類組排列的分析引起了科學(xué)家的關(guān)注。蛋白質(zhì)分離和測(cè)定的最近進(jìn)展顯而易見。人體血清中的蛋白質(zhì)測(cè)定具有重要意義，是臨床診斷的重要依據(jù)。人血清蛋白臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目有血清總蛋白測(cè)定、白蛋白測(cè)定、γ-球蛋白測(cè)定、粘蛋白測(cè)定等。其中,總蛋白的測(cè)定方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法和折射法。凱氏定氮法操作繁瑣,雙縮脲法干擾較大,折射法不能用于總蛋白量少于35g/L的樣品測(cè)定。近年,分光光度法測(cè)定血清蛋白質(zhì)總量的報(bào)導(dǎo)較多。而用極譜法和伏安法測(cè)定蛋白質(zhì)尚未見報(bào)導(dǎo)。本文研究用極譜法測(cè)定蛋白質(zhì)。在含0.070mol/LKClpH為2.66的Britton-Robinson緩沖溶液中,蛋白質(zhì)在-1.90V左右呈現(xiàn)一靈敏示波極譜波,利用此波可測(cè)定10-8mol/L蛋白質(zhì)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1蘇金堂血清學(xué)儀的制備JP-1A型示波極譜儀(成都儀器廠);pHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);78-1磁力加熱攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠);FSH-2型可調(diào)高速勻漿器(江蘇金壇大地自動(dòng)化儀器廠和環(huán)保儀器廠)。γ-球蛋白和人血清白蛋白(衛(wèi)生部上海生物制品研究所);牛血清白蛋白(BSA):稱取牛血清白蛋白(上海伯奧生物科技公司)66mg,加水溶解,稀釋至10mL,濃度為1.0×10-4mol/L;質(zhì)量控制血清(臨床實(shí)驗(yàn)室用,衛(wèi)生部上海生物制品研究所和衛(wèi)生部臨床診斷試劑中心),凍干。上述試劑均在4℃保存;Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液;0.70mol/LKCl溶液。其它試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)過程中均使用二次蒸餾水。1.2p-aa分析移取0.20mLBSA溶液于10mL比色管中,加入2.00mLpH為2.66的B-R緩沖溶液及1.0mL0.70mol/LKCl溶液,用水稀釋至10mL,放置20min,在JP-1A型示波極譜儀上記錄極譜圖,測(cè)定-1.90V處導(dǎo)數(shù)波高。2結(jié)果與討論2.1不穩(wěn)定極譜波的測(cè)定在B-R溶液中,當(dāng)pH值小于1.5時(shí),觀察不到極譜波,pH值在2.3～3.2之間時(shí),BSA產(chǎn)生靈敏的極譜波;pH大于5.0時(shí),極譜波消失。在pH值為2.66的B-R緩沖溶液中,當(dāng)有0.070mol/LKCl存在時(shí),BSA在-1.90V左右產(chǎn)生一良好的極譜波,利用此波可測(cè)定微量的BSA,線性范圍為4.5×10-8～2.0×10-6mol/L,檢測(cè)下限為2.7×10-8mol/L.2.2條件試驗(yàn)2.2.1酸值對(duì)波高的影響在弱酸性溶液下,BSA可產(chǎn)生極譜波。當(dāng)pH值小于2.3時(shí),pH值增加,波高增大;當(dāng)pH值大于3.2時(shí),pH值增加,波高降低;當(dāng)pH值在2.3～3.2范圍內(nèi)時(shí),波高變化很少,本文取pH值為2.66。2.2.2不同緩沖溶液對(duì)bsa的影響固定BSA和KCl的濃度,分別用B-R緩沖溶液和HOAc-NaOAc緩沖溶液控制pH值為2.66。結(jié)果表明,僅在B-R緩沖液中BSA才能產(chǎn)生穩(wěn)定的極譜波。我們選B-R溶液作為緩沖溶液。2.2.3溫度對(duì)bsa波高的影響試驗(yàn)了溫度對(duì)波高的影響。結(jié)果表明,在3～40℃范圍內(nèi),溫度對(duì)BSA波高的影響不顯著,本實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。時(shí)間對(duì)BSA極譜波高有顯著影響。溶液配制完畢,放置20min后,波高在3h內(nèi)穩(wěn)定不變,我們?nèi)》胖脮r(shí)間為20min.2.2.4kcl和nano3對(duì)bsa的影響試驗(yàn)了KNO3,NaNO3,KCl和NaCl等支持電解質(zhì)對(duì)BSA極譜波高的影響。結(jié)果表明,除KCl外,KNO3,NaNO3,NaCl均對(duì)波高無顯著影響。KCl的濃度顯著影響B(tài)SA的峰電位和峰電流,KCl濃度增大,峰電位正移。表明Cl-可能與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。KCl的濃度對(duì)峰電流的影響顯著。KCl的濃度增大,波高增加,當(dāng)KCl濃度大于0.060mol/L時(shí),波高穩(wěn)定,本文選定KCl的濃度為0.070mol/L.2.2.5非離子表面活性劑試驗(yàn)了CTMAB,CPB等陽離子表面活性劑,OP,Tween-60,Tween-80和Tritonx-100等非離子表面活性劑對(duì)BSA峰電流的影響。結(jié)果表明,它們對(duì)BSA波高均無顯著影響。2.3線性范圍和檢測(cè)限制2.3.1校正曲線回歸方程在所選定的底液條件下,改變BSA的濃度,測(cè)定導(dǎo)數(shù)波高,得校正曲線。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在2.19～3.00mg/L范圍內(nèi),校正曲線回歸方程為Y=1.13X-2.4,相關(guān)系數(shù)為0.999;BSA質(zhì)量濃度在3.0～125mg/L范圍內(nèi),校正曲線回歸方程為Y=0.046X+1.9,相關(guān)系數(shù)為0.987;式中Y為μA,X為mg/L.2.3.2方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi),取最小質(zhì)量濃度的BSA(2.19mg/L),平行測(cè)定20份溶液的波高,得峰電流平均值im為0.072μA,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.030μA,根據(jù)公式D=2σC/im計(jì)算得檢測(cè)下限為1.80mg/L,濃度為2.7×10-8mol/L.2.4金屬元素和有機(jī)物對(duì)bsa測(cè)定的影響試驗(yàn)了常見陽離子、陰離子及某些有機(jī)物對(duì)BSA極譜波高的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,生物體內(nèi)存在的金屬陽離子和陰離子,如K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Cu2+,Zn2+和Cl-等以及維生素、肌酐、尿酸、葡萄糖等有機(jī)物對(duì)BSA的測(cè)定均無影響。2.5樣品分析2.5.1校正曲線的制作用所提出的方法測(cè)定了質(zhì)量控制血清中蛋白質(zhì)總量,質(zhì)量控制血清由湖南醫(yī)科大學(xué)提供,是采用健康豬血清經(jīng)處理后凍干而成。該血清中各組分含量如下:K+,4.45mmol/L;Na+,134.8mmol/L;Cl-,92.6mmol/L;P,40.2mg/L;Ca2+,116.8mg/L;尿酸,70mg/L;葡萄糖,1.19g/L;肌酐,14.7mg/L;總蛋白,61.4g/L。按照說明書,每瓶加入3.00mL水,使其溶解,移取1.00mL,用水稀釋至10mL,用作工作液。移取此液0.15mL,按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定波高。用BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液制作校正曲線。根據(jù)文獻(xiàn),血清中含白蛋白5.2%左右,球蛋白2.0%左右,由BSA校正曲線回歸方程計(jì)算出白蛋白量后,再乘以系數(shù)1.38((5.2%+2.0%)/5.2%),得總蛋白量為(68.6±8.5)g/L,與標(biāo)稱值61.4g/L接近。2.5.2導(dǎo)數(shù)波高的測(cè)定取上述質(zhì)量控制血清工作液0.10mL(總蛋白質(zhì)量為0.686mg),加入表1中所示量的BSA,按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定導(dǎo)數(shù)波高,結(jié)果列于表1。回收率在87%～106%之間,結(jié)果滿意。2.6反應(yīng)機(jī)制的研究2.6.1電毛細(xì)曲線實(shí)驗(yàn)測(cè)定了BSA-KCl體