瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的，是由D-半乳糖和3、6-脫水-L-半乳糖結合的鏈狀多糖，含硫酸根比瓊脂少，因而分離效果明顯提高。瓊脂糖電泳具有以下優(yōu)點：①瓊脂糖含液體量大，可達98%?99%，近似自由電泳，但樣品的擴散度比自由電泳小，對蛋白質(zhì)的吸附極微；②瓊脂糖作為支持體有分辨率高、重復性好等優(yōu)點；③電泳速度快；④透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定；⑤區(qū)帶可染色，樣品易回收，有利于制備。瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學研究中常用的技術，可用于分離，鑒定和純化DNA片段。DNA分子在電泳時帶負電荷，因此在電場中向正極移動。DNA分子的遷移率決定于DNA分子大小、DNA的構型、凝膠濃度、電場強度四個因素。凝膠中的DNA可與熒光染料漠化乙錠(EB)結合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此可分析實驗結果。DNA分子的大?。壕€性DNA分子的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比。DNA分子的形態(tài)：在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快，線性DNA分子比開環(huán)DNA分子快。瓊脂糖濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率是不相同的。相反，在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，不同大小的DNA片段的遷移率也是不同的。若要有效地分離不同大小的DNA，應采用適當濃度的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠濃度(％，w/v)可分辨的線性DNA片段大小(kb)0.45?600.70.8?101.00.4?61.50.2?41.750.2?32.00.1?3電場強度：每厘米凝膠電壓不超過5V，若電壓過高分辨率會降低，分離的線性范圍會變窄。只有在低電壓(1V/cm)時，線性DNA分子的電泳遷移率與所用電壓成正比。電場強度偏高還會產(chǎn)生大量熱量，引起DNA片段的降解。一般來講，大分子用較低電場強度以避免拖尾，小分子用較高電場強度以避免擴散。操作步驟：小膠板一般需凝膠15ml，如果用八孔梳子，可加樣15叫。如果需要回收DNA片段，可適量擴大體積，并使用大齒梳子。凝膠濃度根據(jù)DNA分子大小而定。將凝膠成形模具水平放置于模具托盤中，將選好的梳子放好，梳子底部與模具之間會大約留1mm空間。稱取DNA電泳用瓊脂糖0.12g放入專用的三角燒瓶中，加入15ml0.5XTAE緩沖液，混勻后，將燒瓶置于微波爐中，中低火3min，直至瓊脂糖完全溶解（0.8%）。關閉微波爐，取出三角燒瓶，將其置室溫下冷卻至70°C左右（手握燒瓶可以耐受），再加入漠化乙錠（10mg/ml）1.5pl，輕輕混勻后（注意不要劇烈晃動，以免產(chǎn)生氣泡），將凝膠溶液倒入膠板鋪板。室溫下待凝膠完全凝固，需時約30分鐘，拔出梳齒，將膠板放入電泳槽中。在電泳槽加入0.5XTAE緩沖液，以高出凝膠表面2mm為宜。（電泳槽中的緩沖液一般重復利用，如果發(fā)現(xiàn)緩沖液渾濁，應及時更換）取Ep管一支，加入樣品10pl，6x上樣buffer2pl；或者樣品9pl，10X上樣buffer1pl。吹吸混勻，短暫離心。用微量移液器吸取樣品，加入點樣孔中，注意加樣器吸頭應恰好置于凝膠點樣孔中，不可刺穿凝膠，也要防止將樣品溢出孔外。根據(jù)DNA分子大小選擇Marker，上樣3pl，在凝膠的最左側。接通電源，根據(jù)DNA分子大小調(diào)節(jié)電壓。如果發(fā)現(xiàn)電壓正常，電流變小，遷移速率明顯變慢，應更換電泳緩沖液。電泳適當時間后，將凝膠板取出，在紫外燈下觀察結果。一般漠酚藍條帶移動到距離凝膠前沿2cm處時停止。注意事項:漠化乙錠為一種有毒試劑，使用時一定要戴手套操作，注意防護。50TAEtris 242gNa2EDTA.2H2O 37.2g加入800ml的去離子水，充分攪拌溶解。加入57.1ml的醋酸，充分混勻。加去離子水定容至1L，室溫保存。常見問題解決：DNA電泳的MARKER怎么是扭曲的？?配制膠時的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制的，最好是同時配制。電泳時緩沖液高過液面1一2mm即可。?電泳時電壓過高，可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3V/cm)，等條帶出孔后比較漂亮了，然后再調(diào)電壓。?上樣時盡量慢慢加樣，等樣品自然沉降后再加電壓。跑出的DNA帶模糊？DNA降解：避免核酸酶污染。?電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。所用電泳條件不合適：電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度V30°C；巨大DNA鏈電泳，溫度應V15C；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。DNA上樣量過多：減少凝膠中DNA上樣量。DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。?有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。DNA變性：電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。3.有不規(guī)則DNA帶遷移對于久/HindIII片段cos位點復性：電泳前于65°C加熱DNA5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm；溫度V30C；經(jīng)常更換電泳緩沖液。DNA變性：以20mMNaClBuffer稀釋DNA，電泳前勿加熱。跑出的DNA條帶弱或無DNA帶DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量。DNA降解：避免核酸酶污染。DNA走出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。對于EB染色的DNA，所用光源不合適，應用短波長（254nm）的紫外光源。分子大小相近的DNA帶不易分