《中國藥典》療法中療法定刺成分的含量

《中國藥典》療法中療法定刺成分的含量

這種復雜的多酚類化合物，是一種復雜的水下雙酚類化合物。廣泛分布于植物材料，如五倍子、貫草、兒茶等。近年來,對鞣質生理活性的研究方興未艾。研究表明,鞣質能清除生物體內過剩的自由基,維護細胞膜的流動和蛋白質的構象,防止輻射誘發(fā)的DNA斷裂,從而在抑制脂質過氧化、心血管病、抗癌、抗突變、抗衰老、抗白內障等方面有獨特功效。鞣質的經(jīng)典含量測定方法有很多種,如重量法、容量法、比色法等。最常用的有皮粉法、高錳酸鉀法、干酪素法、絡合量法。皮粉法是國際公認的鞣質含量測定方法。皮粉的主要成分是蛋白質,鞣質可通過分子中的酚羥基與蛋白質的酰胺基形成氫鍵而結合成不溶于水的沉淀,以重量法測定含量。《中國藥典》一部鞣質含量測定法一直沿用皮粉法,適用范圍廣。缺點是耗用樣品多,測定時間長,且沒有選擇性,測定結果偏高,而且皮粉用量很大。近年來,皮粉試劑的供應和質量都很難保證,使皮粉法的應用受到很大限制。《英國藥典》2002版鞣質測定法附錄采用的是磷鉬鎢酸-皮粉比色法,即利用鞣質在堿性溶液中將磷鉬鎢酸還原,產(chǎn)生深藍色,其吸收度與含量成正比,采用比色法測定。其中,以焦性沒食子酸為對照,測定總酚和不被皮粉吸附的酚,二者之差計為鞣質的含量。羅文毓等報道了改進的干酪素法,其關鍵步驟是以干酪素代替皮粉,采用磷鉬鎢酸比色法測定;藥材樣品提取采用浸泡過夜代替加熱回流提取等。本文參照《英國藥典》和干酪素法,重點對提取方法、顯色劑、干酪素用量等進行了比較,提出了鞣質含量測定方法,為藥典相關附錄方法的修訂提供了實驗基礎。1試劑與藥品化學品島津UV-2100,2201紫外分光光度計,Agilent8453紫外分光光度計;鎢酸鈉(分析純,廣東汕頭西隴化工廠)、鉬酸鈉(分析純,北京化學試劑公司)、硫酸鋰(分析純,天津天河化學試劑廠)、無水碳酸鈉(分析純,北京化學試劑公司);磷酸(北京化學試劑公司)、鹽酸(北京化學試劑公司)均為分析純;干酪素(生化試劑,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠);焦性沒食子酸(分析純,貴州遵義市建強化工廠);鞣酸(遵義,北京化學試劑商店分裝);沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:0831-9501);五倍子、地榆藥材(均為徐繼民藥師采自吉林通化、河北張家口等地或購自中藥材市場,并進行鑒定)。2實驗方法2.1種比色液最大吸收波長測定結果取對照品、總酚和不被吸附的多酚比色液,在400～1000nm波長測定,結果三種比色液均在760nm具最大吸收。因此,確定測定波長為760nm。2.2加熱和冷浸提取兩種方法的比較《英國藥典》2000版鞣質測定法藥材供試液提取方法采用加熱提取,羅文毓等報道,鞣質遇熱不穩(wěn)定,采用室溫浸提過夜的方法操作簡單,提取完全。本試驗對加熱和冷浸提取兩種方法進行了比較,結果見表1。結果表明,冷浸過夜提取測定含量高于加熱提取法,且操作較簡單。因此,附錄正文采用室溫浸提過夜的提取方法。2.3皮粉法和干酪素法《英國藥典》法采用皮粉作為吸附劑測定不被吸附的多酚類。參考文獻干酪素對鞣質的吸附更具專屬性,即可選擇性吸附有生理活性鞣質,而鞣酐等非活性鞣質則不被吸附,選擇性較皮粉法高。以鞣酸為例,試驗分別采用皮粉和干酪素為吸附劑,測定含量。結果皮粉法測定值為81.18%,干酪素法測定值為62.26%。2.4干結構測定樣品的制備試驗考察了干酪素的用量對測定結果的影響。結果見表2。結果表明,對于測定樣品,三倍取樣量的干酪素用量基本可吸附完全。試驗使用干酪素0.6克。2.5照照劑的確定《英國藥典》2000版鞣質測定法附錄采用焦性沒食子酸為對照品,試驗表明焦性沒食子酸很不穩(wěn)定,溶液在室溫放置很快變色,必須新鮮配置使用。考慮到?jīng)]食子酸具有相似的結構和顯色行為,且已有含量測定用對照品,可以作為鞣質含量測定對照物質。實驗比較了焦性沒食子酸和沒食子酸分別作為對照的測定情況。以鞣酸含量測定為例,采用不同對照物比較測定結果:以沒食子酸對照,測得含量平均值為62.26%,以焦性沒食子酸對照,測得含量平均值為45.45%。以沒食子酸對照,含量值較高。3方法學的檢驗3.1線性關系研究本法為標準曲線法,每次測定均隨行測定,現(xiàn)舉3次測定數(shù)據(jù),表示線性關系情況,見表3。3.2重復試驗取樣品6份,按正文方法測定,測得含量結果見表4。3.3加樣回收率測定取同一樣品4份,分別精密稱取約75mg,置250ml量瓶中,分別精密加入鞣酸溶液(以沒食子酸計含量為62.26%)50ml,加水100ml,按供試品溶液制備方法制備,并按總酚和不被吸附的多酚測定法分別測定含量,計算回收率。結果見表5。4樣品測定4.1對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對照品50mg,置100ml棕色量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。4.2磷鰲銻酸溶液的稀釋精密量取對照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml,分別置25ml棕色量瓶中,各加入磷鉬鎢酸試液1ml,再分別加水11ml、10ml、9ml、8ml、7ml,用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度,搖勻。以相應的試劑為空白,照分光光度法(附錄ⅤB),30分鐘后,在760nm波長處測定吸收度,以吸收度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。4.3供試品溶液的制備取五倍子、地榆藥材,粉碎,過三號篩,分別稱取0.15g和0.75g,精密稱定,置250ml棕色量瓶中,加水150ml,放置過夜,超聲處理10分鐘,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,靜置(使固體物沉淀),濾過,棄去50ml初濾液,精密量取續(xù)濾液20ml,置100ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。4.4加樣中沒食子酸的量總酚測定精密量取供試品溶液2ml,置25ml棕色量瓶中,照標準曲線制備項下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液1ml”起,加水10ml,同法測定吸收值,從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg),計算,即得。不被吸附的多酚測定取供試品溶液25ml,加至已盛有0.6g干酪素的100ml具塞錐形瓶中,密塞,置30℃水浴中保溫1小時,時時振搖,取出,放冷,搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液2ml,置25ml棕色量瓶中,照標準曲線制備項下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液1ml”起,加水10ml,同法測定吸收值,從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg),計算,即得。鞣質含量=總酚量-不被吸附的多酚量樣品測定結果見表6:5測定條件的改進5.1本法主要參考了《英國藥典》鞣質測定法附錄方法。經(jīng)過實驗,主要在以下四個方面進行了改進:(1)《英國藥典》法采用單點對照計算方法。比色法含量測定受到的影響因素較多,實驗表明線性曲線有明顯的截距值。在同樣測定條件下,單點對照計算結果偏高,標準曲線法測定結果的準確性較好。因此,本法改為采用標準曲線測定方法。(2)《英國藥典》法采用焦性沒食子酸為對照品,計算含量。鑒于焦性沒食子酸不穩(wěn)定的性質,本法改用沒食子酸作為對照物。(3)實驗比較了皮粉和干酪素吸附的測定結果,皮粉吸附的測定值明顯高于干酪素吸附,表明干酪素的吸附作用更具專屬性。(4)《英國藥典》法皮粉吸附步驟是在樣品濃溶液階段,10ml溶液加0.2克皮粉吸附后,濾過液量很少,再精密吸取2ml稀釋,操作難度較大,且總酚測定和不被吸附的多酚測定需兩次精密稀釋操作。本法改為取樣品提取液25ml,定容至100ml制成稀釋液,取25ml進行干酪素吸附步驟,濾過后,溶液直接用于測定。不僅減少了精密稀釋步驟,吸附液的量也足夠進行移液管的清洗等使用。5.2《中國藥典》鞣質含量測定法一直沿用皮粉法,該法