細(xì)菌多重pcr檢測(cè)方法的優(yōu)化

細(xì)菌多重pcr檢測(cè)方法的優(yōu)化

細(xì)菌污染飲用水的水源可能導(dǎo)致各種疾病的爆發(fā)和流行。正確監(jiān)測(cè)這些細(xì)菌對(duì)確保軍隊(duì)和人民的健康具有重要意義。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)鑒定技術(shù),操作繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng),并且由于培養(yǎng)技術(shù)的局限,使得一些微生物難以培養(yǎng)和檢測(cè),而免疫學(xué)方法存在特異性或敏感性問題。PCR技術(shù)以其敏感度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速而被廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測(cè),但常規(guī)PCR一次檢測(cè)只能針對(duì)一種細(xì)菌,而水、食品中可能存在眾多屬、種和型別的致病菌。多重PCR方法可克服以上不足,為致病菌的檢測(cè)提供快速、特異、敏感的診斷檢測(cè)。本研究通過(guò)篩選致病菌多重PCR引物,建立和優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系,配合濃縮集菌設(shè)備,特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀氏菌、肺炎克雷伯菌、軍團(tuán)菌、腸出血性大腸埃希菌O157:H7、幽門螺旋桿菌、大腸埃希菌、霍亂弧菌、結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽桿菌13種致病菌。1材料和方法1.1材料和機(jī)器1.1.1菌株基因型和基因組dna實(shí)驗(yàn)所使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株中幽門螺旋桿菌、肺炎克雷伯菌、軍團(tuán)菌購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC),金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀氏菌、大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌O157:H7由重慶市出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室提供,霍亂弧菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽桿菌和結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為生物芯片上海國(guó)家工程研究中心實(shí)驗(yàn)室保存(表1)。1.1.2dna試劑盒r-TaqDNApolymerase、TitaniumTaqDNApolymerase、DL2000TMDNAMarker及100bpDNALadderMarker購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)工程公司,PCRbuffer、Mg2+及dNTP購(gòu)自北京天根生化科技有限公司,ddH2O購(gòu)自美國(guó)Lonza公司,E.Z.N.A.BacterialDNAKit(D3350-01)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司,瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司。1.1.3儀器、檢測(cè)方法PTC-100PeltierPCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad,USA),5415D微量臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf,Germany),MilliflexPlus濃縮儀(Millipore,USA),RAD300電泳儀(AmershamBiosciences,USA),GIS-2010凝膠成像系統(tǒng)(Tianneng,China)。1.2方法1.2.1菌株培養(yǎng),接種2d單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯(CM301,北京陸橋),37℃分別培養(yǎng)48、24和24h;腸出血性大腸埃希菌O157:H7和大腸埃希菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯(CM106,北京陸橋),37℃培養(yǎng)24h;志賀氏菌接種于GN增菌液(CM218,北京陸橋),37℃培養(yǎng)24h;沙門菌接種于氯化鎂孔雀綠肉湯(CM209,北京陸橋),37℃培養(yǎng)24h;軍團(tuán)菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯(含5%羊血,5%胎牛血清),37℃微需氧(7.1%CO2,79.7%N2,7.1%H2,6%O2)條件下培養(yǎng)3d;幽門螺旋桿菌接種于哥倫比亞瓊脂(含5%胎牛血清,7%羊血)中,微需氧(79.7%N2,7.1%H2,7.1%CO2,6%O2)條件下連續(xù)培養(yǎng)7～10d。使用E.Z.N.A.BacterialDNAKit(D3350-01)試劑盒提取致病菌DNA,溶液須置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2pcr引物的篩選根據(jù)GenBank中13種致病菌的序列,通過(guò)序列比對(duì)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),篩選出13種微生物的特異DNA序列。由于GenBank上這些菌株的序列資源較為豐富,分析這些特異序列之后直接進(jìn)行靶序列的篩選,并根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,得到了針對(duì)這13種菌株的13對(duì)PCR引物,同時(shí)選擇所有細(xì)菌中都含有的16S基因設(shè)計(jì)引物和探針作為陽(yáng)性參照。使用在線工具Primer3.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),且所有引物設(shè)計(jì)完成后,進(jìn)行Blast,選取與GenBank已有序列的同源性不高于40%,以確保引物之間的特異性。引物序列和長(zhǎng)度見表2。本實(shí)驗(yàn)中將設(shè)計(jì)篩選出的引物分成3組:P1、P2、P3(表3),進(jìn)行相關(guān)多重PCR試驗(yàn)。本研究所設(shè)計(jì)的引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。1.2.3pcr擴(kuò)增過(guò)程采用15μL的PCR體系,包括10×PCRTaq酶緩沖液1.5μL,DNA模板1.0μL,引物(20μmol/L)0.6μL,dNTP(2.5mmol/L)0.2μL,T-TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL,ddH2O11.5μL。多重PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性3min,接著作30個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s、68℃退火并延伸30s;循環(huán)結(jié)束后68℃延伸5min,冷卻到16℃,產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆?。?μL多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果,其余在4℃保存?zhèn)溆谩?.2.4退火溫度對(duì)pcr產(chǎn)物的影響采用引物等比例添加的PCR反應(yīng)體系,設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)的退火溫度分別為61～72℃,所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),根據(jù)電泳圖條帶的亮度選擇合適的退火溫度。1.2.5dna的pcr檢測(cè)按照已經(jīng)設(shè)計(jì)好的3組多重PCR引物分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每一組中使用各標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA作為模板,同一退火溫度下進(jìn)行PCR反應(yīng)。最初采用等比例添加的方式,之后調(diào)節(jié)不同引物之間的添加比例,引物濃度為20μmol/L,PCR體系的其余成分不變。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),根據(jù)電泳圖條帶的亮度選擇合適的引物比例。1.2.6引物用量的確定在確定引物比例之后,采用最佳引物比例的PCR反應(yīng)體系,保持引物比例和濃度不變,調(diào)節(jié)引物總用量,設(shè)計(jì)引物用量分別為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μL,在同一退火溫度下進(jìn)行多重PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),根據(jù)電泳圖條帶的亮度選擇合適的引物用量。1.2.7多重pcr試驗(yàn)提取標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA并測(cè)定其濃度,將DNA調(diào)整到20ng/μL,然后進(jìn)行10倍梯度稀釋,即進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)的DNA濃度分別為2×10～2×10-8ng/μL,每個(gè)濃度的DNA各取1μL分別進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)。以腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13076為研究對(duì)象,使用標(biāo)準(zhǔn)菌株按照GB/T4789.4-2008中的方法進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),取陽(yáng)性腸炎沙門菌培養(yǎng)物(菌落計(jì)數(shù)測(cè)定其菌濃度約109cfu/mL),用無(wú)菌生理鹽水作10倍梯度稀釋,然后每個(gè)稀釋梯度的菌液各取1L用MilliflexPlus濃縮儀濃縮集菌,提取DNA并溶解于50μLddH2O中,進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)。2結(jié)果2.1pcr檢測(cè)結(jié)果為驗(yàn)證多重PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性,根據(jù)設(shè)計(jì)的3組檢測(cè)引物,分別選取不同細(xì)菌的DNA模板制備成多個(gè)DNA混合樣本,進(jìn)行多重PCR反應(yīng);利用正交反應(yīng)多次試驗(yàn),3組引物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖1～3。根據(jù)電泳圖可以看出,3組多重PCR引物均可以有效、特異地?cái)U(kuò)增出所需的目的條帶,得出了正確的檢測(cè)結(jié)果。由于大腸埃希菌和腸出血性大腸埃希菌O157的親緣關(guān)系很近,因此用大腸埃希菌引物和O157菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生1條特異性的條帶;但用O157菌的引物擴(kuò)增大腸埃希菌的DNA無(wú)條帶產(chǎn)生,因此,不影響O157菌的檢出。這表明本研究所設(shè)計(jì)的多重PCR體系性能良好,3組多重PCR引物可用于相關(guān)致病菌的檢測(cè)。2.2多重pc優(yōu)化2.2.1退火溫度對(duì)pcr的影響根據(jù)圖示結(jié)果,PCR反應(yīng)在退火溫度較低(如溫度為63℃)時(shí)出現(xiàn)較多的雜帶;隨著退火溫度的升高,在退火溫度較高(如溫度為68℃)時(shí)能觀察到清晰易于分辨的電泳條帶,可以獲得較好的PCR結(jié)果,見圖4;溫度繼續(xù)升高,超過(guò)70℃時(shí),將引起個(gè)別產(chǎn)物的丟失。綜合各組引物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,退火溫度在66～68℃時(shí)可以獲得最佳的反應(yīng)結(jié)果,因此,在之后的實(shí)驗(yàn)中選取66～68℃作為多重PCR的退火溫度。2.2.2引物用量對(duì)多重pcr檢測(cè)效率的影響引物添加比例:初次進(jìn)行多重PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí),各引物按照等比例添加,之后根據(jù)電泳圖中各引物所產(chǎn)生條帶的亮度,增減各引物的比例。根據(jù)圖5的電泳結(jié)果,在退火溫度為68℃時(shí),第1組引物的多重PCR在引物添加比例為1∶1∶1∶2∶3時(shí),所產(chǎn)生的一些擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶偏弱;當(dāng)引物添加比例為1∶1∶1∶2∶3～1∶1∶1∶3∶4時(shí),各基因之間可以獲得比較均勻的擴(kuò)增效率;繼續(xù)改變引物添加比例,將會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶,而且增加引物的用量將會(huì)造成檢測(cè)成本的提高。按照同樣的方法,對(duì)第2組和第3組引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),選擇最佳的引物添加比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,第2組引物在添加比例為1∶1∶4∶1時(shí),可以獲得較好的擴(kuò)增效率,而第3組引物在添加比例為8∶1∶8∶4∶4時(shí)的擴(kuò)增效率最高。引物總用量:在確定了各引物之間的添加比例之后,混合引物使用總量也是影響多重PCR擴(kuò)增效率的一個(gè)重要因素。引物的用量太少,不足以進(jìn)行PCR反應(yīng);引物量太多,有可能由于大量過(guò)量的引物之間的相互反應(yīng)而引起非特異擴(kuò)增的產(chǎn)生。以第1組引物為例,對(duì)不同的菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增,混合引物用量減少時(shí),將引起擴(kuò)增效率的降低,如混合引物用量在0.2μL時(shí),志賀菌DNA只能產(chǎn)生很微弱的電泳條帶,而沙門菌DNA則無(wú)電泳條帶產(chǎn)生。在引物用量為0.6μL時(shí)均可獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果。進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果顯示,繼續(xù)增加引物的用量,對(duì)多重PCR的擴(kuò)增效率無(wú)明顯改進(jìn),因此,選取0.6～0.8μL為最佳的引物用量(圖6)。2.3pcr擴(kuò)增效果及電泳結(jié)果用多重PCR方法擴(kuò)增經(jīng)10倍梯度稀釋的致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA,所得結(jié)果如圖7所示。以腸炎沙門菌(ATCC13076)為例,PCR反應(yīng)在DNA的量低至2×10-2ng/μL時(shí)仍可以擴(kuò)增出全部特異性目的條帶。綜合所有引物的擴(kuò)增效率,本研究確立的多重PCR方法靈敏度檢測(cè)限為2×10-2ng/μL,在此檢測(cè)限以上可以擴(kuò)增出全部特異性條帶。腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液經(jīng)10倍梯度稀釋后,提取DNA進(jìn)行多重PCR,所得結(jié)果如圖8所示。電泳結(jié)果顯示,在1泳道至5泳道均出現(xiàn)明顯的條帶,6泳道以后沒有條帶出現(xiàn),說(shuō)明該方法可檢測(cè)細(xì)菌的量為105cfu/mL。為提高檢測(cè)水平,通過(guò)MilliflexPlus濃縮儀對(duì)稀釋后的菌液進(jìn)行濃縮富集后再提取DNA,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。由電泳圖可以看出,使用MilliflexPlus濃縮儀濃縮集菌后,可以顯著提高多重PCR的檢測(cè)水平,可檢測(cè)腸炎沙門菌的量達(dá)到103cfu/mL。3多重pcr檢測(cè)傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很難對(duì)難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定,而且靈敏度低、特異性不高、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng),不能起到有效的監(jiān)測(cè)、預(yù)防作用。自從1988年首次報(bào)道利用多重PCR技術(shù)診斷異基因臍帶血干細(xì)胞移植治療假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)以來(lái),該方法已被廣泛地應(yīng)用于基因組結(jié)構(gòu)、功能基因、數(shù)量性狀基因座的定位以及致病菌的檢測(cè)中。范宏英等建立了同時(shí)