蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因研究課件

蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因研究

田爽

蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因研究

田爽1轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果蘋(píng)果為世界四大水果之一，是我國(guó)的第一大水果，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但是，由于果樹(shù)育種周期長(zhǎng)、遺傳背景復(fù)雜，傳統(tǒng)的雜交育種方式很難選育出集各種優(yōu)良品質(zhì)于一身的品種近年來(lái)隨著社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，培育優(yōu)質(zhì)的蘋(píng)果新品種成為民眾的迫切要求。轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果2基因工程的發(fā)展為蘋(píng)果品種的遺傳改良提供了新的技術(shù)方法，縮短育種周期，提高育種效率，為蘋(píng)果遺傳育種研究、利用各種遺傳種質(zhì)資源開(kāi)辟了一條新的技術(shù)途徑轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果3究竟怎樣定義轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果？

轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果研究進(jìn)展如何？

它存在哪些問(wèn)題？轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果究竟怎樣定義轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果？

轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果研究進(jìn)展如何？

它存4主要內(nèi)容定義發(fā)展歷史

研究現(xiàn)狀研究進(jìn)展存在問(wèn)題主要內(nèi)容定義5轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenetechnology）1定義轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，6“轉(zhuǎn)基因技術(shù)”

（GeneticallyModifiedTechnology）是指使用基因工程或分子生物學(xué)技術(shù)(不包括傳統(tǒng)育種、細(xì)胞及原生質(zhì)體融合、雜交、誘變、體外受精、體細(xì)胞變遷及多倍體誘導(dǎo)等技術(shù))，將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入活細(xì)胞或生物體中，產(chǎn)生基因重組現(xiàn)象，并使之表達(dá)并遺傳的相關(guān)技術(shù)“轉(zhuǎn)基因技術(shù)”

（GeneticallyModifie72發(fā)展歷史自1988年首例使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成的轉(zhuǎn)基因果樹(shù)－核桃誕生以來(lái)，隨后，1989年James等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)共培養(yǎng)法獲得了轉(zhuǎn)基因綠袖(Greensleeves)蘋(píng)果，報(bào)告基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和胭脂堿合成酶基因1992年程家勝等在國(guó)內(nèi)報(bào)道了獲得轉(zhuǎn)基因的蘋(píng)果試管苗，與James等一樣，用綠袖作為受體植株，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，不同的是抗卡那霉素的標(biāo)記基因?yàn)榘被咸橇姿徂D(zhuǎn)移酶[APH(3)I]基因，報(bào)道基因?yàn)槠咸烟擒账崦富?發(fā)展歷史自82發(fā)展歷史植物轉(zhuǎn)基因的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、激光法、花粉管通道法等。在植物上轉(zhuǎn)化成功的例子中，80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的。

2發(fā)展歷史

2發(fā)展歷史2發(fā)展歷史

2發(fā)展歷史2發(fā)展歷史2發(fā)展歷史2發(fā)展歷史93.1蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因的受體基因型近年來(lái)，在全世界果樹(shù)研究者的努力下，轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果已取得不小的成就，用于蘋(píng)果遺傳轉(zhuǎn)化研究的受體基因型越來(lái)越多，除了綠袖，主要還有

紅元帥、新喬納金、嘎拉、金冠、M26、皇家嘎拉、Elstar、Braeburn、Merlijin、喬納金、富士、王林、金矮生、遼伏、元帥、粉紅佳人以及M7和八楞海棠等3研究現(xiàn)狀3.1蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因的受體基因型3研究現(xiàn)狀103研究現(xiàn)狀3.2導(dǎo)入的外源基因目前為止，導(dǎo)入的外源基因有GUS基因、GFP基因、Bt基因、LFY基因、nptⅡ基因、CpTI基因、殺菌肽基因、抗菌肽MB39基因、FT基因、硫堇蛋白R(shí)s-afpl基因、ALS基因(抗除草劑)、rol基因(生長(zhǎng)素合成酶基因)、光敏色素B基因、LeIRT、Ferrition等其中抗性基因分別提高了蘋(píng)果的抗蟲(chóng)性、抗病性和抗除草劑的能力；rol基因的導(dǎo)入使蘋(píng)果苗在田間表現(xiàn)矮化；光敏色素B基因使蘋(píng)果的生長(zhǎng)量和干重不同程度減少3研究現(xiàn)狀3.2導(dǎo)入的外源基11

同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)化材料的選擇不再停留在最初的抗性材料篩選上，GUS組織化學(xué)檢測(cè)及分子水平的檢測(cè)(PCR或Southern雜交)技術(shù)被普遍采用。由于GUS基因可以在農(nóng)桿菌中表達(dá)，而農(nóng)桿菌在轉(zhuǎn)化后的離體培養(yǎng)中至少能存活12個(gè)月而不表現(xiàn)生長(zhǎng)，所以GUS陽(yáng)性結(jié)果不能準(zhǔn)確反映初步轉(zhuǎn)化頻率

于是，另外一種報(bào)道基因——綠色熒光蛋白(GFP)被用于蘋(píng)果的遺傳轉(zhuǎn)化3研究現(xiàn)狀

同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)化材料的選擇不再停留在最初的抗性材料篩選上，12作為熒光標(biāo)記分子，GFP既具有敏感的標(biāo)記檢測(cè)率，又沒(méi)有放射性的危害。GFP檢測(cè)方便，熒光穩(wěn)定，易于構(gòu)建載體且對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒害，對(duì)目的基因的功能也沒(méi)有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞可以繼續(xù)傳代。目前，GFP被改造作為轉(zhuǎn)基因植物的遺傳標(biāo)記，成為監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)基因表達(dá)的的十分重要的報(bào)告因子另外，許多實(shí)驗(yàn)研究表明甘露糖/PMI篩選體系以pmi為安全標(biāo)記基因，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞安全、高效的正向選擇。3研究現(xiàn)狀

作為熒光標(biāo)記分子，GFP既具有敏感的標(biāo)記檢測(cè)率，又沒(méi)有放射性13

3.3外源基因?qū)氲姆椒ㄖ苯訉?dǎo)入法化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)入法、電穿孔發(fā)、脂質(zhì)體法、微注射法、基因槍法（微彈轟擊法）和花粉管通道法等間接導(dǎo)入法土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和植物病毒載體系統(tǒng)3研究現(xiàn)狀

3.3外源基因?qū)氲姆椒?研究現(xiàn)狀143.3外源基因?qū)氲姆椒ㄔ谔O(píng)果基因轉(zhuǎn)化中主要應(yīng)用電穿孔法、基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其簡(jiǎn)便、高效成為應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)化方法。3研究現(xiàn)狀

3.3外源基因?qū)氲姆椒?研究現(xiàn)狀153.4轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果的鑒定遺傳轉(zhuǎn)化的最終目的是獲得能穩(wěn)定表達(dá)且遺傳外源目的基因的轉(zhuǎn)化植株，這就需要不斷觀察和檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株在田間的表現(xiàn)目前使用的轉(zhuǎn)基因植物的鑒定方法有:分子檢測(cè)、免疫技術(shù)、利用生理生化指標(biāo)、標(biāo)記基因和生物鑒定法3研究現(xiàn)狀

3.4轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果的鑒定3研究現(xiàn)狀163研究現(xiàn)狀

3.4轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果的鑒定全面檢測(cè)需要：1檢測(cè)插入外源基因：先做個(gè)普通PCR檢測(cè)，傳統(tǒng)的要southern雜交檢測(cè)插入幾個(gè)拷貝，現(xiàn)在可以用Real-Time檢測(cè)拷貝數(shù)；2表達(dá)量檢測(cè)：RT-PCR，northern雜交，Real-TimeRT-PCR；3蛋白水平檢測(cè)：western雜交4報(bào)告基因檢測(cè)：Gus，GFP/YFP/RFP等

3研究現(xiàn)狀

3.4轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果的鑒定17

4研究進(jìn)展蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因的方法主要有:農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、激光法、花粉管通道法、脂質(zhì)體法、微注射法、電穿孔法等?，F(xiàn)在，在經(jīng)常使用的蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，電穿孔法、基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法使用的最多。4研究進(jìn)展蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因的方法18

4研究進(jìn)展4.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法現(xiàn)在，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的發(fā)展潮流是提高轉(zhuǎn)化效率和擴(kuò)大轉(zhuǎn)化范圍。常見(jiàn)的影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化頻率的因素有三大類：侵染力,抗生素,基因型。4研究進(jìn)展4.1農(nóng)桿菌介194研究進(jìn)展侵染力農(nóng)桿菌的侵染力取決于本身的特性及其受體植株的敏感性。細(xì)菌的菌株對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響很大。最常用的致瘤農(nóng)桿菌菌株是LBA4404，EHAl05和EHA101，也常用A208SE，A136，C58/Z707最常用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株則是1855NCPPB和ATCCl5834。4研究進(jìn)展侵染力204研究進(jìn)展抗生素抗生素的濃度，種類對(duì)轉(zhuǎn)化都會(huì)產(chǎn)生影響。常用的卡那霉素，用量50～100μg/ml，因物種不同而異，卡那霉素的濃度和加入時(shí)間須根據(jù)外植體和物種的不同進(jìn)行預(yù)先實(shí)驗(yàn)基因型基因型是影響蘋(píng)果遺傳轉(zhuǎn)化率的重要因素，其特異性一般認(rèn)為與材料的生理狀態(tài)有關(guān)，不同株系間進(jìn)行轉(zhuǎn)化有差別，且同一屬間差異也往往較大。轉(zhuǎn)化細(xì)胞能否高效再生是基因轉(zhuǎn)化的主要障礙，受到所用組織的很大影響。4研究進(jìn)展214研究進(jìn)展4.2電穿孔法這種方法也被稱為電激法。在使用電穿孔法的研究報(bào)告中，大多數(shù)的研究報(bào)告是轉(zhuǎn)化原生物質(zhì)的報(bào)告。4.3微彈轟擊法此法也稱基因槍法，最近發(fā)展很快。可用于基因槍法的植物組織、器官相當(dāng)廣泛，常用的材料是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞、營(yíng)養(yǎng)胚或合子胚、愈傷組織、花粉粒、花軸、葉柄、幼葉、子葉。4研究進(jìn)展4.2電穿孔法224研究進(jìn)展4.4花粉管通道法

花粉管通道法是一種較老的植物轉(zhuǎn)化方法,是我國(guó)科學(xué)家周光宇在1983年首次在“MethodsinEn-zymology”報(bào)道的研究成果4.5吸脹法花粉管途徑法和吸脹法的最大優(yōu)點(diǎn)就是簡(jiǎn)單易行，不需要貴重、復(fù)雜的設(shè)備，無(wú)須離體培養(yǎng)就可獲得再生植株。4研究進(jìn)展4.4花粉管通道法23

5存在問(wèn)題首先，因?yàn)殡x體材料再生體系的不完善，蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因技術(shù)盡管發(fā)展的很迅速，但是有些品種由于基因型不同，再生率不高，因此不能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化其次，是關(guān)于基因沉默和丟失的問(wèn)題，外源基因整合到受體以后經(jīng)常表現(xiàn)出不表達(dá)或者丟失等現(xiàn)象，這是一個(gè)很普遍的問(wèn)題另外，移栽成活率不高，即使獲得轉(zhuǎn)化植株，但由于移栽不能成活，致使不能大面積應(yīng)用生產(chǎn)，理論與實(shí)際難以結(jié)合5存在問(wèn)題245存在問(wèn)題目前，蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)入瓶頸階段。第一，轉(zhuǎn)化方法單一，主要使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法第二，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的轉(zhuǎn)化效率很低

Puite等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的嘎拉、金帥、E1star的轉(zhuǎn)化效率分別為0.7%～8.0%，0.2%～6.0%,0.4