實時熒光定量PCR在臨床醫(yī)學中的應用

實時熒光定量PCR在臨床醫(yī)學中的應用羅氏應用科學部在臨床醫(yī)學的整體解決方案基因診斷病原體測定腫瘤診斷基因差異表達研究

主要內(nèi)容PCR與基因診斷技術4基因診斷即通過核酸的分子生物學檢測直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病做出診斷的方法。Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈式反應，是一種DNA的快速擴增技術。1998年，熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測。熒光定量PCR技術實時熒光定量PCR技術，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。

熒光染料：SYBRGreenI、EVAGreen，ResoLight

熒光探針：TaqMan、HybridizationProbes、MolecularBeacon6

羅氏應用科學部整合細胞組學和基因組學的研究流程LightCycler?Real-TimePCRPlatform

超過十年的實時熒光PCR的技術革新

LightCycler?1.0

Instrument32320SamplenumberDetectionchannelsSamplevolume[μl]

LightCycler?2.0

Instrument32620/100

LightCycler?1536

Instrument153620.5–2μl19982003

20092005/2008

LightCycler?480Instruments(I,II)96/3845/610-100/5-20BreakthroughtohigherThroughputLightCycler?480廣泛的應用

絕對定量相對定量基于熔解曲線的基因分型終點法基因分型ATAATT基于HRM的突變掃描羅氏應用科學部在臨床診斷的整體解決方案基因診斷病原體測定定性分析絕對定量耐藥性研究腫瘤診斷基因差異表達研究

主要內(nèi)容熒光定量PCR技術的臨床應用10病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關病原體（CT、NG、UU、HPV）的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒II型（HSV）、風疹病毒其它病原體檢測：結核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等HBVDNA檢測縮短“窗口期”11PCR檢測“窗口期”核酸檢測縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于獻血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷熒光定量PCR方法檢測HBV感染的各期12血清標本Copies/mlHBeAg陽性慢性乙型肝炎病人經(jīng)α干擾素治療后HBeAg轉陰非活動性HBsAg攜帶者血清原先血中HBVDNA陽性，已痊愈超過12個月的血清乙肝的治療13治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類：

α干擾素：重組人α-1b干擾素、α-2a、α-2b干擾素等核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。HBsAg和HBeAg均陽性而HBVDNA陰性？14干擾素或拉米夫定等治療后病毒復制受抑制。PCR所用引物相應的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對結合。病毒DNA整合于宿主肝細胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏。抗病毒治療中存在的問題

——逆轉錄酶催化中心YMDD變異15YMDD：酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟保↖）或纈氨酸（V）形成YIDD變異株或YVDD變異株HBV-YMDD變異檢測的臨床意義16動態(tài)檢測：服用拉米夫定3個月開始，每月檢測1次提前發(fā)現(xiàn)：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1-4個月檢測出突變株及時調(diào)整：適時調(diào)整用藥方案，防止因耐藥而導致病情惡化HRM的應用介紹

用12個MIRU–VNTR位點對結核桿菌菌株進行基因分型YuPangetalJournalofMicrobiologicalMethods2011inpress不同MIRU40位點重復標準品的HRM分析結果

.R=repeat88個菌株不同MIRU40數(shù)量的Tm值的統(tǒng)計流行病學研究小結18熒光定量PCR可以對致病微生物核酸含量進行定量檢測彌補免疫檢測的缺陷（如HCV）縮短診斷的窗口期（如HIV），利于早期診斷對治療過程進行療效監(jiān)測指導用藥過程及劑量，以制定合理的療效方案結合臨床表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)的免疫學、影像學等診斷方法來綜合評判，更為科學。羅氏應用科學部在臨床醫(yī)學的整體解決方案基因診斷病原體測定腫瘤診斷突變檢測——個性化用藥甲基化基因差異表達主要內(nèi)容高分辨率熔解曲線

定義高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統(tǒng)的熔解曲線分析的延伸:它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR儀器與專門的分析算法分辨率高，可以區(qū)分一個堿基突變的多組核酸樣本，可以區(qū)分野生型（純合子）、突變型（純合子），雜合子使我們可以不必測序直接篩查PCR擴增產(chǎn)物中是否存在遺傳學變異(SNPs,mutations)與其它方法相比，具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優(yōu)點；而且通量更高，單次成本更低！HRM的應用SNP位點的檢測(已知與未知位點)單倍型分析，雜合性喪失的篩查,種群中優(yōu)勢等位基因分析，物種鑒定,DNA遺傳作圖，潛在易感基因的篩選醫(yī)學應用：產(chǎn)前診斷，傳染病與遺傳疾病的監(jiān)控，藥物療效的觀察突變，包括小片段的插入和缺失醫(yī)學應用：腫瘤的快速診斷,治療與預后評價甲基化應用醫(yī)學應用：腫瘤的快速診斷,治療與預后評價飽和熒光染料

創(chuàng)新的飽和熒光染料能夠識別單堿基突變,并且不抑制PCR反應不飽和雙鏈DNA熒光染料SYBRGreenI純合子和雜合子的熔解曲線基本相同飽和雙鏈DNA熒光染料ResoLight、LCGreen、EvaGreen都為綠色熒光染料，最佳激發(fā)波長范圍440-470nm，發(fā)射熒光波長470-520nm。序列的變化會導致熔解曲線的顯著變化純合子雜合子VSvs創(chuàng)新的HRM染料準確區(qū)分野生型純合子和雜合子

LC480HRMMasterMix–ResoLightDye

SYBRGreenIvs

LightCycler?480ResoLightDye后者提供更高的信號靈敏度和分辨率24HRM技術和dHPLC的分辨率比較

dHPLC

HRMwtmuthetwtwtwtwtwtmutmutmutmutmutwthetnoseparationof

homozygousvariantFABEx15J,318bpamplicon,SNPA/GPCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線

基于基因掃描的基因分型26兩種同源雙鏈兩種異源雙鏈觀察到的4種雙鏈結構雜合子擴增基因掃描

高分辨率熔解分析

純合子野生型(homoduplexes)純合子突變

型(homoduplexes)雜合子案例:LPLH3基因的突變(SNPCT)72樣品，PCR產(chǎn)物大小164bpLightCycler

480HRM應用介紹

基因掃描–顯著降低測序成本甘露糖結合凝集素MBL2基因序列變異分析(384個樣本,擴增子長度219bp):4種最常見的基因型在圖像上被分為4組;少量樣本呈現(xiàn)另外的3種遺傳變異29突變定量分析：CYP2C9目前約有16%的臨床藥物由其負責代謝(如華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因)portionTallele50%,1:120%,1:514%,1:710%,1:104%,1:250%144bpamplicon,SNPC/T30凝血因子VIII的突變檢測第八因子的單堿基替換導致了50%急性血友病A。由于該基因轉錄本長達9kb，且外顯子較?。?9–262bp)，利用dHPLC或者測序檢測昂貴耗時。用HRM可篩選出90%的突變。DetectionofFactorVIIIGeneMutationsbyHigh-ResolutionMeltingAnalysis.Laurieetal.ClinChem.2007HRM法檢測KRAS基因的敏感性結果31擴增片段92bp，突變型質(zhì)粒所占的比例分別為0%、2%、5%、10%、20%、50%、100%的混合質(zhì)粒DNA系列中，HRM分析方法可以明顯的檢測出只含2%的突變型DNA。50%20%100%10%5%WT2%14%不同的KRAS突變類型在HRM判讀圖譜中顯示出與野生型不同的突變型的曲線32羅氏應用科學部在臨床醫(yī)學的整體解決方案基因診斷病原體測定腫瘤研究突變檢測甲基化檢測基因差異表達研究主要內(nèi)容34在一般正常的細胞中，CpG成分處于非甲基化的狀態(tài)甲基化研究對于了解基因的調(diào)控模式以及疾病的分子生物學機制具有重要意義：發(fā)育、癌腫瘤發(fā)生、基因印跡、X染色體失活及相關遺傳性疾病在特定條件下，譬如許多發(fā)育相關基因，在發(fā)育的特殊階段去甲基化表達腫瘤的DNA甲基化改變表現(xiàn)為總體的甲基化水平降低與啟動子區(qū)CpG島的甲基化水平升高。抑癌基因與修復基因的甲基化導致抑癌基因沉默與修復基因失活;而總體低甲基化使反轉錄轉座子、癌基因活化和染色體不穩(wěn)定基于甲基化特定標志物的量化情況，對不同的病人進行風險水平分級DNA甲基化現(xiàn)象和疾病研究

2.PCR擴增，脲嘧啶經(jīng)PCR擴增后變?yōu)樾叵汆奏?，使甲基化差別轉換為堿基序列差別TCmCU1.重硫酸鹽處理已變性的DNA，未甲基化的胞嘧啶轉變?yōu)殡遴奏CmCCU3.分析:測序，甲基化特異性PCR，

引物延伸，限制性酶消化，

雜交…

orReal-timePCR!DNA甲基化研究的常規(guī)流程

結直腸癌FFPE樣品啟動子甲基化測定

HighQualityAssessmentofDNAMethylationinArchivalTissuesfromColorectalCancerPatientsUsingQuantitativeHigh-ResolutionMeltingAnalysis.Balic,M.etal.(2009),J.Mol.Diagn.11,102-108.在腫瘤發(fā)生過程中，超甲基化的啟動是一個常見的抑制基因轉錄的機制，它也同時被視為腫瘤發(fā)生的特點之一。適當保存的組織是檢測重要的生物標志物的重要來源。在早期癌癥監(jiān)測、風險分析和治療中，DNA甲基化分析方法是一個理想的手段。使用HRM分析方法，可以穩(wěn)定地檢測到1%的甲基化DNA3