蛋白質(zhì)的相互作用研究方法

兩個或兩個以上的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起執(zhí)行生物學(xué)功能時，發(fā)生相互作用。使蛋白質(zhì)到發(fā)揮作用的位點。使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，激活或抑制。蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用和識別在諸如生物催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種生命過程起著重要的作用。第三節(jié)蛋白質(zhì)的相互作用的研究方法免疫共沉淀Co-immunoprecipitation(Co-IP)GSTpull-downassay熒光共振能量轉(zhuǎn)移FluorescentResonantEnergyTransfer（FRET）雙分子熒光互補(bǔ)（BimolecularFluorescentComplement）BIFC酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwo-HybridSysterm其它方法1.原理

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的結(jié)合蛋白。優(yōu)點：生理條件下的結(jié)合缺點：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用一、免疫共沉淀2.方法1)收獲培養(yǎng)的細(xì)胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次2）細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30min3)12000rpm離心30min4）收集上清并加入適量抗體，4oC搖動1h～過夜5）加入ProteinA/G-Sepharose(瓊脂糖凝膠)懸液，4oC搖動1h6）細(xì)胞裂解液洗滌ProteinA/G-Sepharose混合液7）離心棄上清8）沉淀加2×蛋白LoadingBuffer煮沸5－10min9）離心，上清液跑SDS膠10）考馬氏亮蘭染色、銀染W(wǎng)esternBlot質(zhì)譜分析3.注意事項1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑，如商品化的cocktailer。2）使用明確的抗體，有的抗體不適宜做免疫共沉淀。3)對照實驗的設(shè)計。二、GST融合蛋白進(jìn)行Pulldow實驗

1原理細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s－轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的相互作用時，可以啟用GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。

兩種應(yīng)用：1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用2）證實探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用

2方法：

1）GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a,單一明確的重組蛋白；b，細(xì)胞裂解蛋白混合液；c,體外翻譯cDNA表達(dá)得到的未知蛋白）2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng)4oC2h3）離心棄上清4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，離心5）取上清進(jìn)行SDS電泳，6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做WesternBlot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：該實驗設(shè)立GST對照，反應(yīng)均在4oC進(jìn)行GST-PulldownAssay三、Fluorescenceresonanceenergytransfer熒光信號的產(chǎn)生

熒光基團(tuán)在某波長的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個更長波長的發(fā)射光。什么是FRET?當(dāng)某個熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團(tuán)距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，這個過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),實際相當(dāng)于將短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。3.綠色熒光蛋白

60年代，Shimomura等首先從水母（AequoriaVictoria

）中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,

后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。OsamuShimomura

OsamuShimomurainthelabinthebasementofhishome.Heisholdingasampleof“real”GFPisolatedfromAequoreavictorea,notproducedbybacteria.

InordertodohisresearchShimomuraestimatesthathecollectedoveramillionAequoreaspecimens。（OneAequoreaweighabout50g）WilliamWard(right)metDouglasPrasheronajellyfish-huntingexpeditioninthe1980s

DouglasPrasherwasthefirstpersontorealizethepotentialofGFPasatracermolecule.GFPcouldbeusedtoreportwhenaproteinwasbeingmadeinacell.GFPcouldpotentiallybeaveryusefulreportermolecule.容易檢測分子量小不需要其它底物DouglasPrasher1992克隆了GFP基因Chalfie將GFP基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。SergeyA.Lukyanov在珊瑚中發(fā)現(xiàn)了類似GFP的蛋白。他還發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。RogerTsien對GFP的機(jī)理作出了貢獻(xiàn)。制造了很多GFP突變體。GFPsequenceMSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSHNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYK/2001/07/26/0726gfp_print.html/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm2008年諾貝爾化學(xué)獎GFP主要應(yīng)用:

對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達(dá),如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程。膜蛋白的移動（FluorescenceRecoveryAfterPhotobleachingFRAP）蛋白之間的相互作用（FRET）報告分子將GFP的基因連在特殊的啟動子的后面，可以檢測基因表達(dá)的時間和部位。