熒光分析法PPT培訓(xùn)課件講義

熒光分析法

內(nèi)容熒光光譜基礎(chǔ)；蛋白質(zhì)的熒光特性；熒光分光光度計的結(jié)構(gòu)和原理。吸收光譜和熒光光譜能級躍遷示意圖（一）熒光的產(chǎn)生某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的熒光。此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)射熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)反應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標(biāo)記。（二）熒光效率熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。（三）熒光的猝滅熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需要的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。

物質(zhì)的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，可以用作該物質(zhì)的定性分析。當(dāng)激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，其發(fā)射光強度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，可以用作定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會有“自熄滅”作用，以及由于在液面附近溶液會吸收激發(fā)光，使發(fā)射光強度下降，導(dǎo)致發(fā)射光強度與濃度不成正比，故熒光分析法應(yīng)在低濃度溶液中進行。蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光

蛋白質(zhì)在270-300nm有吸收，這種吸收主要來自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，所以蛋白質(zhì)具有天然熒光。當(dāng)用280nm波長激發(fā)時，蛋白質(zhì)大致有相同的熒光光譜，最大值在313nm和350nm處。前者恰與酪氨酸一致，后者恰與色氨酸一致，沒有色氨酸的組蛋白只給出最大在313nm的熒光光譜，沒有芳香族氨基酸的蛋白質(zhì)不顯示熒光。

三種氨基酸的熒光光譜

應(yīng)用

熒光分光光度計通過測定樣品經(jīng)激發(fā)后發(fā)射出的熒光進行定性或定量分析。熒光定量分析法靈敏度高、選擇性好，已廣泛運用于地質(zhì)、冶金、化工、環(huán)保、生物、食品、化學(xué)等領(lǐng)域，可對維生素、蛋白質(zhì)、藥物、農(nóng)藥及無機物進行定量分析和熒光光譜的測定。

儀器儀器結(jié)構(gòu)原理圖1。RF-5301PC型熒光分光光度計實現(xiàn)世界最高水平的S/N比，達150以上。最適合高靈敏度、高分辨率測定。提供豐富的數(shù)據(jù)處理、顯示功能。

2。AMINCO-Bowman?Series2型熒光分光光度計光源雙光源設(shè)計，氙燈、閃光燈150W連續(xù)照明燈的光照強度足以進行靈敏度很高的熒光測量；閃光燈既可用于磷光測量，又可用于熒光測量。可根據(jù)自己的分析要求選擇一種或兩種光源。

單色器

單色器均為Seya-Namioka設(shè)計，采用凹面全息光柵和為數(shù)極少的反射鏡。既簡單又耐用，不需要現(xiàn)場校準(zhǔn)。計算機驅(qū)動光柵，控制狹縫，既準(zhǔn)確(+/-0.1nm)、又快(12000nm/min)，可靠性高。

檢測器

采用光電倍增管檢測器。PMT有兩種工作模式：a.模擬――高靈敏度，寬動態(tài)范圍，操作方便；b.光子計數(shù)――提供極高的靈敏度,聯(lián)結(jié)式蓋鎖可保護PMT。

技術(shù)特點

1.時間分辨技術(shù)

時間分辨發(fā)光光譜技術(shù)是基于不同發(fā)光體的發(fā)光衰減速率的不同進行組分的分辨和分別測定的技術(shù)。

時間熒光光譜2.偏振和各向異性技術(shù)在偏振光激發(fā)下，熒光體所發(fā)射的熒光在空間不同取向強度不同，即偏振光。此技術(shù)在生化領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用，如生物分子間的締合反映，抗體或抗原的測定等。3.同步掃描技術(shù)同步掃描技術(shù)可分為固定波長差、固定能量差和可變波長同步掃描，具有使光譜簡化，提高選擇性，減少影響等特點。4.三