一種非淀粉中性多糖的分離與鑒定

一種非淀粉中性多糖的分離與鑒定

甘薯是天南星科植物，具有多年生草本植物，可作為草葉、葉柄、花、腫瘤等藥物使用。芋頭即為芋的地下塊莖,具有消疬散結作用,其主要功效成分有花青甙、甾醇、過氧化氫酶等,也有人曾報道芋頭中含有水溶性多糖,且含有雜聚糖,但沒有更為詳細的資料。通過實驗分離獲得了芋頭中的非淀粉性多糖(TPS),并就其理化特性和體內免疫調節(jié)活性進行了研究1材料和方法1.1實驗細胞和試劑DEAE-纖維素(DE-52)為Whatman公司產品;SephadexG-100為Pharmacia公司產品;RPMI1640培養(yǎng)基,美國Gibco公司產品;小牛血清,中國醫(yī)學科學院血液研究所;氘標胸腺嘧啶核苷(3H-TdR):3.7×1003Bq/ml,中國原子能科學研究院;胰酶、DNA酶,華美生物工程公司;4-氨基安替比林,2,5-二苯基惡烷(ppo),1,4-雙-2-(5-苯基惡唑基-2)-苯(popop),ConA,羊抗鼠IgG,Sigma公司。液閃計數(shù)器(IS-800,德國);酶標儀(MR-700型,日本);二氧化碳培養(yǎng)箱(IP-41型,日本);微量取樣器(Sororex,瑞士);離心機(TGL-16B,上海)1.2動物和細胞植物昆明種小白鼠,6-8周齡,(20±2)g,雄雌兼用,6月齡綿羊,豚鼠,均由衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所動物室提供。1.3分組和分組飼料組成(%):面粉25.麥片25,玉米面25,豆面10,魚粉8,骨粉4,酵母粉2,精鹽10將18-22g的健康小白鼠,隨機分成試驗組和對照組。試驗組每日取一定劑量的芋頭多糖TPS純品溶于5mL蒸餾水,直接灌胃給予動物[50mg/(kg·d),150mg/(kg·d),250mg/(kg·d)]陰性對照組給予等量的生理鹽水,持續(xù)7d,進行各項免疫指標測定。1.4檢測柱層黨組織酸性質的鑒定材料準備→前處理→破碎→浸提→離心分離減壓濃縮→乙醇沉淀→離心分離→脫蛋白→透析→離心分離→減壓濃縮→乙醇沉淀→離心分離→溶劑抽干→乙醚回流→DEAE-52纖維素柱色譜→SephadexG-100柱層色譜→純度鑒定-理化性質和生物活性測試。1.5小鼠體內一、三/三血清指數(shù)k小鼠碳粒廓清實驗采用印度墨汁法。在最后一次給予TPS30min后,往小鼠尾靜脈注射印度墨汁0.01mL/g體重。在注射后第2分鐘和第12分鐘時,用預先用肝素溶液潤濕的微量取樣器從小鼠眼眶后靜脈叢取血20μL,混合于2mL0.1%Na2CO3溶液中,搖勻后以0.1%Na2CO3為對照,在680nm處測吸光值(A),按下式計算吞噬指數(shù)(即廓清指數(shù))k。A2,A12一分別指注射印度墨汁后,第2分鐘和第12分鐘時所取血樣的吸光值(4):1.6細胞培養(yǎng)和細胞收集標準平板摻入法,斷頭處死小鼠置于20%潔爾滅冰水中,取出脾臟置于小布袋中擠壓后,制成細胞懸液。取2mL細胞懸液小心地加到1mL淋巴細胞分層液上方,在1600r/min下離心20min,吸出單核細胞層,用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋,借助細胞計數(shù)器計數(shù),調整脾淋巴細胞的最終濃度為5×106個/L。在96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔加入200μL脾細胞溶液,試驗孔加入伴刀豆蛋白使其濃度為5mg/L,陰性對照組加入等量的RPMI1640培養(yǎng)液,每組各做3復孔置于37℃,濕度飽和的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h后,每孔加入3.7×104Bq的,H-TdR25μL,繼續(xù)培養(yǎng)6h。用多頭細胞收集器將細胞收集于玻璃纖維濾紙上(69#),用冷的蒸餾水沖洗30次。80℃烘干,置于測量瓶中,加入5mL閃爍液作閃爍計數(shù)(cpm)1.7細胞培養(yǎng)與轉染3H-TdR摻入法。斷頭處死小鼠,取脾臟制備脾淋巴細胞懸液。將生長良好的對數(shù)生長期的YAC-1細胞用RPMI1640培養(yǎng)液調整其濃度為2×106個/ml,取2mL細胞懸液加入3.7×104Bq/mL的3H-TdR20mL,置于37℃水浴中培養(yǎng)2h,充分洗滌后調整細胞濃度為2×106個/mL。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入50/μL(含1×104個標記細胞),然后每孔加入0.1ml含有1×106個細胞的小鼠脾淋巴細胞懸液,使效應細胞與靶細胞的比例為100:1。另加入相同體積的2%4-氨基安替比林作為最大釋放組,以只加靶細胞不加效應細胞的孔作對照,每一孔設置復孔,置于37℃,濕度飽和的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后,再經(jīng)1500r/min離心10min,從每孔中吸取150μL上清液,補加等量的含0.6mg胰蛋白酶和10mgDNA酶的Hanks液,振蕩1min后,置于37℃保溫30min,用多頭細胞收集器把細胞收集在玻璃纖維濾紙上,洗滌后經(jīng)80℃烘干,放入液閃瓶中加入5mL閃爍液,作閃爍計數(shù)。NK細胞活性按下式計算:NK細胞活性(%)=[空白對照組(cpm)-試驗組(cpm)]/[空白對照組(cpm)-最大釋放組(cpm)〕×1001.8冰浴中l(wèi)10%滌綸紅細胞懸液srbc的測定SRBC免疫法。從小鼠眼眶取血并離心分離血清,用生理鹽水稀釋500倍,吸取1mL稀釋血清加入反應管中,再加入0.5mL10%綿羊紅細胞懸液(SRBC)置于冰浴中。往試管中加入1mL稀釋的豚鼠血清,立即移置于37℃水浴中保溫10min保溫結束后,經(jīng)2000r/min離心10min取上清液1mL,加3mL都氏試劑,混勻后靜置10min,在540mm處測吸光值(4),按下式計算半數(shù)溶血值(HC50)。HC50=(樣品的吸光值÷SRBC半數(shù)溶血時的吸光值)×稀釋倍數(shù)1.9小鼠igg的檢測EIJSA法。從小鼠眼眶取血并分離血清。取適當稀釋的包被羊抗小鼠IgG加入聚乙烯反應板各孔中,置于4℃冰箱過夜,洗滌,甩干;每孔加入不同稀釋濃度的標準品和稀釋待測樣品0.2mL置于37℃,孵育2h使樣品IgG和包被羊抗小鼠IgG反應,洗滌;每孔加入酶標抗體0.2mL,37℃孵育2h,洗滌;每孔加入底物0.2mL,37℃顯色30min,加終止液終止反應,于492nm波長處測吸光度值。以標準品濃度為橫坐標,光密度為縱坐標,在半對數(shù)坐標紙上作標準曲線,以樣品的光密度查出樣品的含量,再乘以稀釋倍數(shù)得待測血清中IgG的含量(ng/mL)1.10統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)以x±s,表示,SAS軟件進行統(tǒng)計處理和顯著性檢驗2結果與討論2.1tps的理化性質1Kg芋頭(干重)粉碎后用水浸提,低溫靜止沉降除去淀粉,取上清液濃縮,離心后用Sevag法脫蛋白8次,置于透析袋中對水透析3d。透析內液真空濃縮至最小體積,加乙醇沉淀,離心收集灰白色沉淀,無水乙醇洗滌干燥得芋頭粗多糖(7.24g)。取芋頭粗多糖1g溶于最小體積水中,利用DEAE-纖維素(DE-52,Cl-型)離子交換色譜分離,用水洗脫,硫酸-蒽酮法檢測多糖峰位,分部收集,乙醇沉淀,溶劑干燥取干燥物溶于0.1mol/LNaCl中,再用SephadexG-100凝膠色譜進行純化硫酸-蒽酮法檢測多糖峰位,分步收集,乙醇沉淀,冷凍干燥后的芋頭多糖TPS組分(0.77g)。TPS為白色粉末狀、無定性固體,元素分析發(fā)現(xiàn)不含氮,分子量為65300。TPS的理化性質見表1。TPS與碘-碘化鉀溶液反應不顯藍色,說明它們是非淀粉類多糖TPS的斐林試劑反應、硫酸咔唑反應、雙縮脲反應、三氯化鐵反應,CTAB反應和280nm吸收均為陰性,說明它不含單糖、糖醛酸、蛋白質、多酚類物質、核酸等,且為中性多糖。2.2tps對小鼠t細胞增殖能力的影響表2是TPS對小鼠體內免疫細胞功能影響的實驗結果。從表2可以看出,實驗所用的3個劑量均不能顯著地提高巨噬細胞吞噬指數(shù),考慮到實驗劑量已足夠大,因此可以得出TPS對小鼠體內腹腔巨噬細胞免疫功能影響不顯著的結果。150mg/(kg·d)的劑量對小鼠體內T淋巴細胞增殖有極顯著的影響(P<0.01),而50mg/(kg·d)、250mg/(kg·d)的劑量都無明顯的作用。TPS對小鼠T淋巴細胞增殖能力的影響中,50mg/kg·d)與其他兩個劑量之間的差異不顯著,而150mg/(kg·d)與250mg/(kg·d)劑量之間的差異顯著(P<0.01),可見TPS對T淋巴細胞增殖能力的影響呈明顯的雙向調節(jié),這與許多植物活性多糖的作用有相同的模式。劑量高于150mg/(kg·d)的TPS可以使NK細胞活性顯著增高(P<0.05,P<0.01),且隨劑量的增加對NK細胞活性的增強作用也越大?？梢奣PS對T淋巴細胞的作用模式與對NK細胞的作用模式截然不同,其機理有待進一步研究。2.3tps對小鼠血清溶血素活性的影響在TPS對小鼠血清溶血素活性影響的研究中發(fā)現(xiàn)(見表3),高于150mg/(kg·d)劑量的TPS可以使血清溶血素活性顯著地提高(P<0.05),而50mg/(kg·d)劑量與對照組以及3個實驗劑量組之間的差異都不顯著,表明TPS對小鼠血清溶血素活性的增強作用比較弱。給予150mg/(kg·d)和250mg/(kg·d)劑量的TPS能使小鼠血清IgG含量顯著地增加(P<0.05),增加百分比分別為44.9%和40.3%,且50mg/(kg·d)劑量與150mg/(kg·d)劑量之間的差異也顯著(P<0.05),說明等于或高于150mg/(kg·d)劑量的TPS對小鼠由IgG引起的體液免疫功能有增強作用。3