sevag法去除當(dāng)歸粗多糖中的蛋白質(zhì)

sevag法去除當(dāng)歸粗多糖中的蛋白質(zhì)

當(dāng)歸糖是一門從后方植物當(dāng)歸糖（oliv.）根提取的糖成分。這些糖含量約為原干燥藥物的85%。它調(diào)節(jié)了生命力，影響了造粒系統(tǒng)，腫瘤和抗輻射。為確切了解當(dāng)歸多糖結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,先要獲得提純的多糖。去除多糖中的蛋白質(zhì)是當(dāng)歸多糖精制過程中的重要一步。目前除多糖中蛋白質(zhì)的常用方法有Sevag法、三氯醋酸法、蛋白酶法、透析法和732樹脂法等。楊鐵虹報(bào)道用反復(fù)凍融法除當(dāng)歸粗多糖中蛋白質(zhì)效果較好,但未見詳細(xì)報(bào)道。本研究通過單因素試驗(yàn)方法建立了Sevag法去除當(dāng)歸粗多糖中蛋白質(zhì)的最佳條件,并與反復(fù)凍融法相比較,為大規(guī)模提純當(dāng)歸多糖提供參考。1儀器、儀器和儀器當(dāng)歸多糖粗提取物(多糖含量75.8%)購(gòu)于山東旺圣藥業(yè)股份有限公司。無(wú)水乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。離心機(jī)(AnkeTDL-40B,上海安亭科學(xué)儀器廠),紫外可見分光光度計(jì)(UV-mini1240,日本島津公司),試管混勻器(SK-1天津華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),分析天平(FA2004,上海精科天平有限公司),冷凍干燥機(jī)(FD-1A-50,北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),磁力攪拌器(HJ-4A,天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。2方法2.1無(wú)水乙醇醇沉法當(dāng)歸粗多糖溶于水,4000r/min離心10min去除雜質(zhì),上清加2倍體積的無(wú)水乙醇醇沉。離心后沉淀用無(wú)水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌至上清液無(wú)色,沉淀凍干后配成的多糖溶液備用2.2機(jī)械研磨法21,51,61和61氯仿與正丁醇體積比設(shè)以下5個(gè)梯度,即2∶1,3∶1,4∶1,5∶1和6∶1。Sevag試劑與當(dāng)歸粗多糖溶液按1∶3混合,攪拌30min后,4000r/min離心10min,取上層糖溶液測(cè)多糖和蛋白質(zhì)含量。2.3監(jiān)獄警察的職責(zé)分類多糖溶液與Sevag試劑的體積比分別為1∶1,2∶1,3∶1,4∶1和5∶1。攪拌30min后4000r/min離心10min,取上層糖溶液測(cè)多糖和蛋白質(zhì)含量。2.4研究對(duì)象多糖溶液與Sevag試劑的攪拌時(shí)間分別設(shè)為10,15,20,25,30,35,40,45,50min。攪拌結(jié)束后4000r/min離心10min,測(cè)上層糖溶液中多糖和蛋白質(zhì)含量。2.5冷凍溶液的制備將多糖溶液置-20℃冰箱冷凍后,室溫溶解,4000r/min離心10min,再冷凍,再溶解。每次溶解、離心后測(cè)上層糖溶液中的多糖和蛋白質(zhì)含量。2.6sevag法與反復(fù)冷凍法的除蛋白質(zhì)作用的比較找出Sevag法除蛋白質(zhì)的最適條件后,與反復(fù)凍融法比較,以確定除蛋白質(zhì)的最佳方法和次數(shù)。2.7測(cè)量和指標(biāo)2.7.1多糖損失率多糖含量用苯酚-硫酸法測(cè)定,用分析純葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。多糖損失率(%)=100×(M1-M2)÷M1。M1:去除蛋白質(zhì)前溶液中多糖的含量;M2:去除蛋白質(zhì)后溶液中多糖的含量。2.7.2蛋白質(zhì)去除率及蛋白前溶液蛋白含量的測(cè)定蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)去除率(%)=100×(N1-N2)÷N1。N1:去除蛋白質(zhì)前溶液中蛋白質(zhì)的含量;N2:去除蛋白質(zhì)后溶液中蛋白質(zhì)的含量。2.8dunpan多重比較所得數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件做單因素方差分析,差異顯著的(P<0.05)用Duncan法做多重比較。表中數(shù)據(jù)用x±s表示,n=3。3結(jié)果3.1蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率不同比例的氯仿與正丁醇與多糖溶液混合后,攪拌30min,測(cè)得的蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率見表1。由表1得知,當(dāng)氯仿與正丁醇比例為4∶1時(shí),蛋白質(zhì)去除率最高,多糖損失率最低。因此氯仿與正丁醇的最適比例為4∶1。3.2蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率的測(cè)定氯仿與正丁醇按4∶1配成的Sevag試劑與當(dāng)歸粗多糖溶液按不同比例混合,磁力攪拌器攪拌30min后,測(cè)蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率。結(jié)果見表結(jié)果表明粗多糖溶液與試劑按和混合,蛋白質(zhì)去除率均較高且二者間差異不顯著,但3∶1時(shí)的多糖損失率顯著低于4∶1,因此粗多糖溶液與Sevag試劑的最適比例為3∶1。3.3混合過程中蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率的測(cè)定當(dāng)歸粗多糖溶液與Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)按3∶1混合,攪拌不同時(shí)間后測(cè)蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率,結(jié)果見表3。攪拌時(shí)間在20～45min時(shí)蛋白質(zhì)去除率均高于70%且差異不顯著。多糖損失率隨攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高。因此攪拌時(shí)間為35min時(shí)最佳。3.4反復(fù)凍融法與sevag法不同處理次數(shù)下多糖去除率在Sevag法除蛋白質(zhì)的最適條件下除蛋白質(zhì)8次,與反復(fù)凍融法比較,結(jié)果見表4～5。由表4可以看出,除蛋白質(zhì)5～8次時(shí)的蛋白質(zhì)去除率較高且差異不顯著,但多糖損失率隨處理次數(shù)的增加而升高。因此Sevag法除蛋白質(zhì)最適次數(shù)為6次。由表5可以看出除蛋白質(zhì)3～8次時(shí)的蛋白質(zhì)去除率相近且差異不顯著,但多糖損失率差異顯著。因此反復(fù)凍融法除蛋白質(zhì)最適次數(shù)為4次。與Sevag法相比,反復(fù)凍融法除蛋白質(zhì)雖然多糖損失率稍高,但蛋白質(zhì)去除率更高,而且處理次數(shù)少。因此反復(fù)凍融法除當(dāng)歸粗多糖中蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于Sevag法。4攪拌時(shí)間對(duì)粗多糖多糖去除率的影響影響Sevag法除蛋白質(zhì)的因素主要有氯仿和正丁醇的體積比、樣品溶液與Sevag試劑的體積比、攪拌時(shí)間等。Sevag試劑中氯仿和正丁醇的比例對(duì)蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率影響較大,需要選擇合適的比例。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同氯仿和正丁醇比例對(duì)蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率均有顯著影響(表1)。樣品溶液與Sevag試劑的比例也很重要。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),粗多糖溶液過多和過少均降低蛋白質(zhì)去除率,多糖損失率隨多糖溶液的增多而升高。在盡可能去除蛋白質(zhì)的前提下,還需盡量縮短處理時(shí)間,因此選擇適當(dāng)?shù)臄嚢钑r(shí)間也很重要。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),攪拌時(shí)間過短和過長(zhǎng)都會(huì)降低蛋白質(zhì)去除率,多糖損失率隨攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)上述影響因子的研究,找出了Sevag法除當(dāng)歸粗多糖中蛋白質(zhì)的最佳條件,即Sevag試劑中氯仿∶正丁醇=4∶1,當(dāng)歸粗多糖溶液(2mg/ml)與Sevag試劑的體積比為3∶1,攪拌時(shí)間為35min。通過比較Sevag法與反復(fù)凍融法的除蛋白質(zhì)效果,發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融法優(yōu)于Sevag法。雖然反復(fù)凍融法的多糖損失率稍高,但蛋白質(zhì)去除率更高,處理次數(shù)少,而且反復(fù)