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文檔簡介
實驗二
PCR檢測乙肝病毒
PCR分析apoB基因多態(tài)性實驗二
PCR檢測乙肝病毒
PCR分析apoB基因多態(tài)性1PCR實驗結(jié)果圖PCR實驗結(jié)果圖2乙肝病毒PCR實驗操作apoB基因PCR多態(tài)性分析血清樣本處理(模板的制備)PCR檢測乙肝病毒PCR反應(yīng)上機口腔細胞總DNA(模板)apoB基因PCR實驗操作PCR反應(yīng)上機實驗安排乙肝病毒PCR實驗操作apoB基因PCR多態(tài)性分析血清樣本處3PCR基本原理及相關(guān)知識PCR基本原理及相關(guān)知識4ThePolymeraseChainReactionSometimescalled"molecularphotocopying,"thepolymerasechainreaction(PCR)isafastandinexpensivetechniqueusedtoamplify,ormakemanycopiesof,smallsegmentsofDNA.Thetechnologyempowersscientiststoundergoanumberofprocesses,fromDNAfingerprintingtomappingthehumangenome.In1983,KaryMullisinventedthePCR.Theprocessisaninvaluabletooltotoday'smolecularbiologistsandbiotechnologycorporations.ThePolymeraseChainReaction5KaryB.MullisAshewrotelaterinScientificAmerican:"BeginningwithasinglemoleculeofthegeneticmaterialDNA,thePCRcangenerate100billionsimilarmoleculesinanafternoon.Thereactioniseasytoexecute.Itrequiresnomorethanatesttube,afewsimplereagentsandasourceofheat."(1944-)TheNobelPrizeinChemistry1993forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method(1/2oftheprize
)KaryB.MullisAshewrotelat63stepand30cyclesforPCRStep1.DenaturationStep2.AnnealStep3.Extend30cyclescreateoverabillioncopiesofthesequence3stepand30cyclesforPCRSt7Step1.Denaturation(變性)Thereactionisfirstheatedtodenature(separate)thesidesofthedouble-strandedDNATemperature:~95degreesCelsius
Step1.Denaturation(變性)There8Step2.Anneal(退火)thencooledtoallowtheprimerstofindandbindtotheircomplementarysequencesontheseparatedstrands.Temperature:~55degreesCelsius
Step2.Anneal(退火)thencooled9Step3.Extend(延伸)thepolymerasetoextendtheprimersintonewcomplementarystrands.Temperature:~75degreesCelsius
Step3.Extend(延伸)thepolymera10RepeattheCyclesRepeatedheatingandcoolingcyclesmultiplythetargetDNAexponentially,sinceeachnewdoublestrandseparatestobecometwotemplatesforfurthersynthesis.Thisprocesscanthenberepeatedupto30timestocreateoverabillioncopiesofthesequence.RepeattheCyclesRepeatedheat111個循環(huán)后的結(jié)果第2個循環(huán)后的結(jié)果模版第1次的產(chǎn)物第2次的產(chǎn)物AABBCD1個循環(huán)后的結(jié)果第2個循環(huán)后的結(jié)果模版第1次的產(chǎn)物第2次的產(chǎn)12第3個循環(huán)后的結(jié)果第3次的產(chǎn)物第4個循環(huán)后的結(jié)果第4次的產(chǎn)物1A,1B,2C,2D,2EAB2C2D2E1A,1B,3C,3D,6(22+2)EAB3C3D6E第3個循環(huán)后的結(jié)果第3次的產(chǎn)物第4個循環(huán)后的結(jié)果第4次的產(chǎn)物13第N個循環(huán)后的結(jié)果第N次的產(chǎn)物1A,1B,(N-1)C,(N-1)D,(2n-2+2)
E……(2n-2+2)
EABN-1CN-1D第N個循環(huán)后的結(jié)果第N次的產(chǎn)物1A,1B,(N-1)C,(N14ComponentsforPCRReactionTemplate(dsDNA)Primers(TWOshortDNA:15-30nucleotidesinlength.Longerprimersprovidehigherspecificity
)P22Taqpolymerase(Thermusaquaticus)dNTPMix(dATP,dGTP,dTTP,dCTP)ReactionBuffer(includingMg2+)ComponentsforPCRReactionTem1510×PCR反應(yīng)緩沖液(buffer):
已作成商品化的產(chǎn)品,它包括:250~500mmol/LKCl;
100~500mmol/LTris-HAC(pH8.4);
15~20mmol/LMgCl2(對Taq酶的活性影響很大,一般濃度為1.5~2.0mmol/L,實際應(yīng)用時根據(jù)反應(yīng)體系的情況進行調(diào)整);
0.1%明膠或牛血清白蛋白10×PCR反應(yīng)緩沖液(buffer):16
影響PCR的主要因素①
PCR反應(yīng)體系的各個組分模板的質(zhì)量、引物的設(shè)計、Taq酶的活性②
PCR循環(huán)的溫度與時間預(yù)變性、變性、退火、延伸③
PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺效應(yīng)④
操作環(huán)境避免污染
影響PCR的主要因素17一般PCR實驗設(shè)計:樣品反應(yīng)不同的退火溫度梯度不同的Mg2+濃度不同的模板濃度陰性對照反應(yīng)陽性對照反應(yīng)一般PCR實驗設(shè)計:樣品反應(yīng)18PCR方法的特點:操作簡便、時間短、特異性高、靈敏度高、實用性強;廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學診斷、分子生物學、分子克隆、基因診斷、法醫(yī)學、考古學等各個領(lǐng)域。PCR方法的特點:操作簡便、時間短、特異性高、靈敏度高、實用19二、PCR試劑盒檢測HBVDNA
實驗操作及注意事項
二、PCR試劑盒檢測HBVDNA20HBV檢測試劑盒介紹構(gòu)成:DNA提取液檢測反應(yīng)管(PCR反應(yīng)體系,上樣buffer,石蠟油)陽性模板設(shè)計:反應(yīng)管中有針對HBV的特異性引物,若出現(xiàn)與陽性對照相同的結(jié)果,則說明待測樣品中含有HBVHBV檢測試劑盒介紹構(gòu)成:21PCR實驗具體操作PCR實驗具體操作221、待測血清中DNA簡單制備待測血清40ml+
40mlDNA提取液,混勻
沸水浴10min,10000rpm×5min樣品模板(用做檢測)無菌水40ml+
40mlDNA提取液
沸水浴10min,10000rpm×5min上清空白模板(做陰性反應(yīng))上清1、待測血清中DNA簡單制備待測血清40ml+
40m23實驗分組陽性反應(yīng)1個陰性反應(yīng)1個樣品檢測反應(yīng)4個陽性模板2ul空白模板2ul樣品模板2ul混勻,6000rpm×5s,上PCR儀實驗分組陽性反應(yīng)1個陰性反應(yīng)1個樣品檢測反應(yīng)4個陽性模板2u2493℃×3min預(yù)變性
94℃,30s55℃,30s72℃,30s
72℃保溫5min30個循環(huán)PCR反應(yīng)程序:93℃×3min預(yù)變性30個循環(huán)PCR反應(yīng)程序:三、PCR檢測
人apoB基因多態(tài)性分析PCR實驗操作及注意事項
三、PCR檢測
人apoB基因多態(tài)性分析26實驗?zāi)康募邦A(yù)期結(jié)果目的:檢測來自不同樣本的基因多樣性檢測技術(shù):apoB基因的PCR預(yù)期結(jié)果:瓊脂糖電泳條帶的差異實驗?zāi)康募邦A(yù)期結(jié)果目的:27apoB多態(tài)性分析的基本實驗過程來源不同的待測樣本PCR擴增目的基因瓊脂糖電泳結(jié)果比較分析apoB多態(tài)性分析的基本實驗過程來源不同的待測樣本PCR擴增28實驗主要步驟apoB基因PCR,1人1份分裝PCR反應(yīng)液每份21ul(包括:
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