臍帶來源間充質干細胞的制備及其質量檢定

臍帶來源間充質干細胞的制備及其質量檢定孫瑞婷;陳瑤瑤;王華;靳繼德;汪勁松;劉冬梅;王立生;吳祖澤【摘要】ObjectiveToestablishapracticalqualitycontrolstandardoftheproductofumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcells(UC-MSCs)forclinicalresearch.MethodsFreshumbilicalcordfromdonorswasobtained.Afteramnionandbloodvesselwasremoved,theWhartonJellywasmincedinto1-2mm3fragmentsandthensuspendedinananimalserum-freeMSCgrowthmediumandincubatedinahumidifiedatmospherewith5%CO2at37°C.Cellsatpassage3wereusedforexperiments.Accordingtoguidelineofqualitycontrolandpreclinicalresearchofstemcells,UC-MSCswereperformedoverallexamination.Theexaminedcontentscontainedsterilitydetection,mycoplasmadetection,human-derivedandswine-derivedvirusscreening,endotoxindetection,cellmorphologyobservation,cellnumberandcellviabilityassay,chromatosomekaryotypeanalysis,immunophenotypeassay,shorttandemrepeatprofiling,immuno-supressactivityanddifferentiationassay.ResultsUC-MSCsfromdonorswerepreparedaccordingtothestandardoperationprocedureforcellisolation,purificationandculture.Throughoverallqualityarbitration,thequalityofUC-MSCscouldbecontrolled.Thecellviabilitywasmorethanorequalto90percentbeforepreservationandmorethanorequalto80percentafterpreservation.UC-MSCswassterile,mycoplasma-free,endotoxin-freeandnon-specifichuman-andswine-derivedvirus.TheUC-MSCswerepositiveforCD90andCD105,whereasnegativeforCD34,CD45,andHLA-DR.Chromatosomekaryotypewasintheformof46XXor46XY,nodeletionandinsertionmutation.STRprofilingverifiedthatUC-MSCsshowedcharacteristichumanSTRprofilesandnocrosscontamination.UC-MSCspossessedmulti-differentiationpotentialandsuppressedheterogenouslymphocyteproliferation.ConclusionWehaveestablishedthequality-controlstandardandsuppliedexperimentaldataforpreparationandexaminationprocedureofumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcells.%目的：研究臍帶來源間充質干細胞（UC-MSCs）的擴增工藝及質量檢驗方法，提出質量控制標準，為臨床研究提供合格的干細胞產(chǎn)品方法新鮮臍帶去羊膜及血管，剪碎，組織塊放入無菌培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)箱進行臍帶間充質干細胞培養(yǎng)、擴增。細胞培養(yǎng)至P3代，按照《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》（征求意見稿）進行干細胞質量的全面檢定。檢定內(nèi)容包括無菌檢測，支原體檢測，人源特定病毒及豬源病毒檢測，內(nèi)毒素檢測，細胞形態(tài)、細胞數(shù)及細胞活率檢測，染色體核型分析，干細胞免疫表型檢測，STR圖譜分析，免疫抑制活性檢測及分化能力檢測。結果按照標準化流程對18根臍帶進行了UC-MSCs的分離、純化及培養(yǎng)，獲得一致性較好的干細胞。通過對干細胞進行質量檢定，很好地控制了干細胞的質量。干細胞活性在凍存前＞90%,凍存復蘇后＞80%;該工藝生產(chǎn)的臍帶MSC產(chǎn)品無細菌、人源特定病毒及豬細小病毒、支原體等微生物污染，內(nèi)毒素檢測陰性；干細胞免疫表型檢測CD90、CD105呈陽性，陽性率不低于95%;CD31、CD34、HLA-DR呈陰性，陽性率不高于2%;染色體核型分析為46XX或46XY，無缺失及插入突變；STR圖譜分析證實干細胞為單一人來源；UC-MSCs具有成脂及成骨分化潛能；UC-MSCs能抑制異源淋巴細胞增殖。結論按本工藝及標準制備的UC-MSCs符合《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》的質量控制標準，為同類干細胞制備及檢定過程標準化提供了實驗依據(jù)期刊名稱】《中國醫(yī)藥生物技術》年(卷),期】2013(000)006【總頁數(shù)】7頁(P401-407)【關鍵詞】間質干細胞;質量控制;細胞表型;分化能力;染色體核型分析;STR圖譜分析【作者】孫瑞婷;陳瑤瑤;王華;靳繼德;汪勁松;劉冬梅;王立生;吳祖澤【作者單位】100022北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院;100850北京，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所;100022北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院;100850北京，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所;100850北京，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所;100850北京，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所;100070北京三有利和澤生物科技有限公司;100070北京三有利和澤生物科技有限公司;100850北京，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所;100850北京，軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所【正文語種】中文干細胞的治療是指自體或異體來源的干細胞經(jīng)過細胞純化，體外擴增和定向誘導分化，制備成為治療所需要的功能細胞，通過細胞轉移修復機體損傷細胞的治療方法目前國內(nèi)外已開展了多項干細胞臨床應用研究，涉及多種干細胞類型及多種疾病類型。主要疾病類型包括骨關節(jié)疾病、肝硬化、移植物抗宿主排斥反應(GVHD)、脊髓損傷及退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病等［1］。研究最廣泛的成體干細胞類型是間充質干細胞，主要來源于骨髓、脂肪組織、臍帶血、臍帶或胎盤組織，它們具有一定的多向分化潛能及抗炎和免疫調(diào)控等能力［2］。與骨髓和脂肪等來源的MSCs相比，來源于臍帶的MSCs具有明顯的優(yōu)勢。臍帶是胎兒的附屬物，胎兒出生后即成為廢棄物，采集對患者不造成任何痛苦。與成體來源的細胞相比，臍帶細胞個體差異較小，質量容易控制，而且細胞的干性和功能活性更好，對許多疾病的治療效果也更明顯［3］。作為一種新型的生物治療產(chǎn)品，生產(chǎn)制備臨床研究用干細胞的整個過程的每一階段，都有可能影響干細胞制劑的質量，須對所使用的干細胞制劑的細胞質量進行相關的研究和控制［4］?；诖?，我們按照《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》對分離得到的UC-MSCs進行了全面的質量檢定。材料與方法材料試劑硫乙醇酸鹽、改良馬丁培養(yǎng)基、支原體半流體培養(yǎng)基及肺炎支原體均購自北京三藥科技有限公司；集菌器購自杭州盈天科學儀器有限公司；鱟試劑及檢查用水購自湛江安度斯生物有限公司；內(nèi)毒素工作標準品購自中國食品藥品檢定研究院；梅毒螺旋體（TP）抗體診斷試劑盒、丙型肝炎病毒（HCV）抗體診斷試劑盒、乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原診斷試劑盒、人免疫缺陷病毒（HIV）抗體診斷試劑盒購自英科新創(chuàng)科技有限公司；巨細胞病毒IgM抗體（CMV）檢測試劑盒購自廣州市康潤生物制品開發(fā)有限公司；鼻咽癌病毒（EBV）核酸測定試劑盒和肺炎支原體（MP）核酸測定試劑盒購自上海之江生物科技股份有限公司；豬細小病毒檢測試劑盒購自西班牙Ingenasa公司；HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、MP、TP熒光定量PCR試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司；CD90-PE、CD105-PE、HLA-DR-PE、CD34-FITC、CD45-PE、IgG2a-PE、IgM-FITC抗體購自美國eBioscience公司；基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；熒光標記的特異擴增引物由美國ABI公司合成；CCK8試劑盒購自日本Dojindo公司；間充質干細胞無血清培養(yǎng)基購自北京三有利科技發(fā)展有限公司。1.1.2儀器FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；ST16R離心機、多功能酶標儀、CO2氣體培養(yǎng)箱均為美國Thermo公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀為美國Roche公司產(chǎn)品；全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)為法國Merieux公司產(chǎn)品；IX51熒光顯微鏡和光學倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱購自上海一恒科學儀器有限公司。1.2方法UC-MSCs的制備參考文獻［5］的方法并進行優(yōu)化。將新鮮臍帶放入大培養(yǎng)皿中，去除羊膜及血管。將分離好的臍帶用眼科剪剪成約1mm3大小的組織塊，取適量放入無菌培養(yǎng)皿中，覆蓋70%培養(yǎng)皿的底面積。加入無血清培養(yǎng)基，左右振搖1min，使組織塊分散均勻。放入5%CO237°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第5天半量更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10d左右，有長梭形細胞從組織塊邊緣長出；14d左右待細胞團長至約50%時倒掉組織塊，同時收集細胞傳代培養(yǎng)。每3天更換一次培養(yǎng)液，并用倒置顯微鏡觀察細胞生長變化，待貼壁細胞長到瓶底的90%時進行消化傳代，加入0.05%胰酶消化，按1:5的比例進行傳代，在傳代的同時使細胞進一步分離純化。傳至第3代時用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配成活細胞密度為5x106個/ml的細胞懸液，用于下述各項檢測。1.2.2無菌檢測按《中華人民共和國藥典》2010年版三部附錄XIIA無菌檢查法進行；利用全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)：取樣品分別加入至需氧培養(yǎng)瓶（BPA）、厭氧培養(yǎng)瓶（BPN）中。將BPA和BPN置入全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng),37C培養(yǎng)7d。1.2.3支原體檢測按《中華人民共和國藥典》2010年三部附錄XIIB支原體檢查法進行。1.2.4人源特定病毒檢測采用ELISA法和實時定量PCR法檢測HIV、HBV、HCV、EBV、CMV、HTLV等人源特定病毒的表達。1.2.5豬源病毒檢測采用ELISA法檢測胰酶中豬細小病毒。1.2.6內(nèi)毒素檢測按《中華人民共和國藥典》2010年版三部附錄XIIE細菌內(nèi)毒素檢查法中的方法1凝膠法進行。1.2.7細胞形態(tài)及活性通過光學倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)；通過臺盼藍染色確定細胞數(shù)及細胞活率。1.2.8染色體核型分析參考文獻［6］的方法，取傳代后第3~4天處于增殖指數(shù)期的細胞（P3代），更換新鮮培養(yǎng)液。加入20pg/ml秋水仙素125pl,作用4h。吸去含秋水仙素的培養(yǎng)液，加入胰酶消化細胞，細胞沉淀用低滲液處理5min,然后加入固定液固定細胞。進行G帶染色，顯微鏡觀察。UC-MSCs免疫表型檢測通過流式細胞儀測定UC-MSCs表面CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR的表達情況。STR圖譜分析提取UC-MSCs基因組DNA，質量鑒定后進行STR位點分析，位點包括9個（D13S317、TH01、D5S818、D16S539、Amelogenin、TPOX、D7S820、CSF1PO、vWA）；使用熒光標記的特異擴增引物分別對9個人源STR位點進行PCR擴增，將不同熒光標記的PCR產(chǎn)物進行稀釋并混合后，進行毛細管電泳檢測，對毛細管電泳檢測結果進行分析，判斷細胞是否存在其他人源細胞污染，該工作委托金唯智生物科技（北京）有限公司完成。UC-MSCs分化能力檢測⑴成骨誘導分化［7］:配制成骨誘導培養(yǎng)液一一10mmol/LP-甘油磷酸鈉，10nmol/L地塞米松，50mg/L維生素C;P3代細胞以2x103個/cm2的濃度接種于6孔板中，等細胞生長至80%融合后，更換為成骨誘導培養(yǎng)液，每2天換液1次，于誘導1、2、3周后，進行茜素紅染色。去培養(yǎng)基,PBS洗2次；70%乙醇固定，4疋，1h;雙蒸水洗2次；40mmol/L茜素紅溶液（pH4.2）室溫染色1-10min;鏡下觀察，照相。⑵成脂誘導分化[8]:除常規(guī)細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基外，加0.5mmol/L異丁基-甲基黃嘌呤、60pmol/L吲哚美辛、0.5pmol/L氫化可的松和10pg/L胰島素。細胞在此種培養(yǎng)基誘導4周后檢測。去培養(yǎng)基，用PBS洗2次;甲醛-鈣室溫固定15min;PBS洗2次；60%異丙醇媒染1min;去異丙醇，油紅O工作液室溫染色30min;60%異丙醇浸洗1次；PBS洗2次；鏡下觀察，照相。1.2.12異常免疫學反應分別采用1.0x104,5.0x104,2.5x105和5.0x105不同細胞量的UC-MSCs，照射后與5.0x104異體外周血CD3+T淋巴細胞(PBLCs)共培養(yǎng)，用終濃度為0.5pg/ml的PHA刺激其增殖，通過CCK-8法檢測UC-MSCs對異體T淋巴細胞增殖能力的影響。結果細胞形態(tài)及活性根據(jù)標準化的UC-MSCs細胞分離、純化、培養(yǎng)和擴增的操作流程，分離了18根臍帶，獲得了一致性及活性較好的細胞。細胞呈長梭形旋渦狀排列(圖1);臺盼藍染色結果顯示細胞活率＞90%,凍存后細胞活率＞80%。無菌試驗依據(jù)《中國藥典》無菌試驗檢測規(guī)程及全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，兩者的檢測結果一致且特異性好。但是，利用薄膜過濾法檢測到陽性樣品的時間較全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)要長，前者需要14d，而后者僅需7d。因此，在實際操作中可同時進行此兩種檢測，以便較早發(fā)現(xiàn)潛在污染。支原體檢測依據(jù)《中國藥典》支原體檢測規(guī)程進行，方法的可重復性很好，不同時間對同一標本進行檢測，結果一致；同時利用熒光定量PCR的方法進行支原體檢測，結果表明該方法靈敏、省時，檢測結果與藥典檢測規(guī)程結果一致。圖1UC-MSCs的形態(tài)（x40）（A:P0細胞形態(tài)；B:P3細胞形態(tài)）FigurelMorphologyofumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcells（UC-MSCs）（x40）（A:Passage0;B:Passage3）細胞內(nèi)外源致病因子的檢測結合ELISA和實時定量PCR的方法，對人源特定病毒包括HIV、HBV、HCV、EBV、CMV、HTLV和TP進行檢測。檢測結果顯示兩種方法的一致性較好，均較靈敏、特異；因細胞傳代培養(yǎng)過程中要使用胰酶，因此，我們還利用ELISA的方法檢測了豬源細小病毒，結果顯示病毒為陰性（表1）。表1豬細小病毒檢測結果TablelResultsofporcineparvovirusdetectedbyELISA注：截斷值二陽性對照（OD）x0.2;樣品OD<截斷值為陰性；樣品OD>截斷值為陽性。Notes:cut-offvalue二ODvalueofpositivemultiply0.2；IfODvalueofsamplelessthancutoffvalue,considerednegative;IfODvalueofsamplegreaterthancutoffvalue,consideredpositive.組另0GroupsOD值ODValue胰酶Trypsin0.081±0.016陰性對照Negativecontrol0.090±0.013陽性對照Positivecontrol1.732±0.013圖2UC-MSCs免疫表型Figure2Immunophenotypeofumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcells內(nèi)毒素檢測結果通過凝膠法檢測細胞培養(yǎng)上清中內(nèi)毒素含量S5EU/ml。UC-MSCs免疫表型檢測流式細胞儀檢測細胞免疫表型，結果表明，CD90和CD105表達陽性，陽性率>95%,CD34、CD45、HLA-DR表達陰性，陽性率<2%（圖2）。染色體核型分析通過染色體核型分析可以將染色體數(shù)目異?；蛴胁迦牒腿笔蛔兊膫€體排除，分析結果表明絕大多數(shù)細胞染色體核型正常，為46XY或46XX（圖3）。STR圖譜分析分析結果表明樣品來源單一，不含有其他人源細胞的污染（圖4）。圖中從左到右，從上到下分別為測量樣品的D13S317、TH01、D5S818、D16S539、Amelogenin、TPOX、D7S820、CSF1PO、vWA位點的擴增結果。UC-MSCs的分化能力UC-MSCs細胞經(jīng)成骨誘導后，茜素紅染色陽性；經(jīng)成脂誘導后，油紅O染色可見明顯的脂肪滴形成（圖5）。結果顯示UC-MSCs具有成骨和成脂等多向分化潛能。圖3UC-MSCs核型分析（A:46XX;B:46XY）Figure3Analysisofchromatosomekaryotype（A:46XX;B:46XY）圖4STR圖譜分析Figure4AnalysisofSTRprofiling圖5UC-MSCs分化能力檢測（A:成骨分化；B:成脂分化）Figure5DifferentiationdetectofUC-MSCs（A:Osteogenicdifferentiation;B:Adipogenicdifferentiation）異常免疫學反應異體來源UC-MSCs制劑對人T淋巴細胞增殖具有抑制作用。這種抑制作用依賴于干細胞的存在，即UC-MSCs與PBLCs的劑量比為0.2:1、1:1、5:1和10:1均具有抑制作用，且抑制作用與干細胞數(shù)量呈正相關（圖6）。圖6PHA刺激后UC-MSCs對CD3+T淋巴細胞增殖抑制作用Figure6InhibitioneffectofUC-MSCsonCD3+TlymphocyteproliferationafterPHAstimulation討論目前，國際上已經(jīng)有5個間充質干細胞產(chǎn)品上市用于治療移植物抗宿主病、骨關節(jié)病、免疫性疾病、急性心肌梗死等。國內(nèi)也有多項干細胞研究進入臨床，但由于細胞的來源和制備條件的差異，細胞的質量難以很好地控制，使臨床治療效果差異較大，甚至帶來不安全的隱患。因此建立細胞的質量標準和質量控制體系是促進MSCs臨床研究和應用健康發(fā)展，保障患者安全的必要措施。干細胞應用過程中最重要的是保證干細胞制劑的無菌、無內(nèi)毒素、無內(nèi)外源致病因子。本研究中對于無菌檢測，不僅采用了藥典所規(guī)定的薄膜過濾法，同時還采用全自動微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)進行快速檢測。結果表明兩者檢測結果一致，而后者培養(yǎng)時間較前者短，因此，在實際質檢過程中可以將全自動微生物培養(yǎng)檢測作為快速檢定的方法；對于細胞內(nèi)外源致病因子的檢測，我們采用了ELISA和PCR兩種方法，分別從蛋白水平及基因水平對人源特定病毒進行檢測，結果表明兩種檢測方法一致性較好，提示實際質檢過程中可以結合兩種方法進行檢定；關于支原體的檢測，藥典規(guī)定直接培養(yǎng)法和指示細胞法，前者檢測時間為28d，后者檢測時間雖沒有前者長，需7~10d,但其操作相對煩瑣；本研究除采用直接培養(yǎng)法之外，采用了實時定量PCR的方法進行檢測，結果與直接培養(yǎng)法一致，同時，該法檢測快速、簡單、結果重復性好。細胞交叉污染也是干細胞應用過程中可能會遇到的問題。目前有多種鑒別和檢測細胞交叉污染的方法，包括同工酶法、HLA分型、細胞核型分析、DNA多態(tài)性等。STR圖譜鑒別是近年來隨著人類基因組研究的不斷深入而發(fā)展起來的一種技術，其可以通過標準化的操作，采用自動化的DNA分析儀對PCR產(chǎn)物進行精確的分析，并以簡單的數(shù)字描述STR序列重復次數(shù)，不僅增加了結果的客觀性，而且所需細胞數(shù)量少、結果穩(wěn)定、特異性強，目前已廣泛應用于人源細胞株的鑒別［9-10］。由于不同細胞具有其特征性的圖譜，所以根據(jù)圖譜的數(shù)據(jù)可以判定細胞是否為單一細胞，這就使得本研究在采用STR圖譜進行人源細胞鑒別的基礎上，可以用該方法進行細胞交叉污染檢測。研究結果提示，STR圖譜分析法是用于人源細胞交叉污染檢測的一種有效手段，可作為干細胞的質檢方法，用于細胞操作過程中交叉污染的監(jiān)測。間充質干細胞的一個重要特點是免疫原性較低，且本身具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以抑制T、B淋巴細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞的成熟和功能［11-13］，因此不論是自體還是同種異體的MSCs，用于治療一般都不會引起宿主的免疫反應。為防止可能出現(xiàn)的異常免疫反應，本研究利用CCK-8法檢測了異體來源的UC-MSCs對于人T淋巴細胞增殖的抑制作用，結果顯示，UC-MSCs可以很好地抑制PHA誘導的T淋巴細胞增殖，這就保證了臨床應用的安全?？傊杉毎委熂夹g是現(xiàn)代再生醫(yī)學的必然歸宿，而建立統(tǒng)一的質檢標準是完成干細胞研究從基礎向臨床順利轉化的保障。參考文獻【相關文獻】SalemHK,ThiemermannC.Mesenchymalstromalcells:currentunderstandingandclinicalstatus.StemCells,2010,28(3):585-596.ChamberlainG,FoxJ,AshtonB,etal.Concisereview:mesenchymalstemcells:theirphenotype,differentiationcapacity,immunologicalfeatures,andpotentialforhoming.StemCells,2007,25(11):2739-2749.SunL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