儀器分析實訓(xùn)報告

PAGEPAGE8生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析實訓(xùn)報告題目：氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量方法學(xué)考察StudyonthemethodologyinvestigationofdetectingnicotinecontentbyGCinternalstandardmethod專業(yè)：食品科學(xué)與工程姓名：張磊洋學(xué)號：完成日期：2012年6月2日氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量方法學(xué)考察【摘要】:煙堿(又稱尼古丁)是煙葉中的主要成分。本次試驗以喹啉為內(nèi)標(biāo)物，煙堿為測定對象，考查及檢測氣相色譜法內(nèi)標(biāo)法測定煙堿含量的方法學(xué)。試驗中以有機溶劑萃取、填充氣相色譜法測定對試驗的重現(xiàn)性及精密度和線性關(guān)系進(jìn)行認(rèn)真分析。一定范圍內(nèi)，煙堿含量的峰高比及面積比呈現(xiàn)線性關(guān)系，重現(xiàn)性及精密度良好。【關(guān)鍵詞】:煙堿內(nèi)標(biāo)法重現(xiàn)性線性關(guān)系精密度StudyonthemethodologyinvestigationofdetectingnicotinecontentbyGCinternalstandardmethodAbstract：Nicotine(alsocallednicotine)isthemainingredient.TobaccoThistrialasinternalstandardwiththings,-1h-quinolin-2-onesnicotinetodetermineobject,examinesanddetectinggaschromatographyinternalstandardmethodfordeterminingthecontentofnicotinemethodology.Experimentswithorganicsolventextraction,fillinggaschromatographywasdevelopedforthedeterminationofthetestthereproducibilityandprecisionandlinearrelationshipbetweenanalyzedcarefully.Acertainrange,highratioofnicotinecontentthanpresentpeakareaoflinearrelation,reproducibilityandprecisionisgood.Keyword：nicotineinternalstandardmethodrepeatabilitylinearrelationaccuracy目錄1緒論…………………51.1煙堿的簡介………….51.2煙堿的結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)…………….51.3煙堿的檢測方法…………………….51.3.1非水滴定法檢測煙堿含量………….51.3.2紫外線分光光度法檢測煙堿含量………………….61.3.3水蒸氣蒸餾法檢測煙堿含量……….61.3.4高效液相色譜法檢測煙堿含量…….61.3.5氣相色譜法檢測煙堿含量………….61.3.5.1外標(biāo)法檢測煙堿含量……………61.3.5.2歸一化法檢測煙堿含量……………71.3.5.3內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量………………71.4檢測方法學(xué)考察……………………71.4.1線性關(guān)系的考察…………………...71.4.2精密度的考察……………………...71.4.3重現(xiàn)性實驗的考察………………...71.4.4吸收率……………...81.4.5驗證性……………...82實驗部分…………...82.1目的.………………...82.2材料和儀器…………82.2.1材料………………….82.2.2儀器………………….82.3色譜條件……………..92.4實驗設(shè)計及結(jié)果分析……………….92.4.1線性關(guān)系實驗的考察……………….92.4.2精密度實驗的考察…………………122.4.3重現(xiàn)性實驗的考察…………………122.4.4結(jié)果分析……………13參考文獻(xiàn)…………13氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測煙堿含量方法學(xué)考察1緒論1.1煙堿的簡介煙堿又名尼古丁，是一種無色至淡黃色透明油狀液體，是煙草中含氮生物堿的主要成分，在煙葉中的含量為1～3%。它能迅速溶于水及酒精中,通過口、鼻、支氣管黏膜，很容易被人體吸收。粘在皮膚表面的尼古丁，可“滲”入人體內(nèi)。香煙中的尼古丁對人的致死量是50～70毫克，相當(dāng)于20～25支香煙尼古丁的含量。如果將一支雪茄或三支香煙的尼古丁一次注入人的靜脈內(nèi),3～5分鐘人即可死亡。對昆蟲具有殺滅作用。

1.2煙堿的結(jié)構(gòu)與物理化學(xué)性質(zhì)煙堿又稱尼古丁，是一種吡啶型生物堿，分子式C10H14N2，結(jié)構(gòu)簡式：存在于煙草屬經(jīng)濟植物中。無色揮發(fā)性液體，有刺激性臭味，熔點－79℃，沸點246.7℃(745毫米汞柱)，相對密度1.0097（20／4℃），比旋光度－169°?？梢运魵庹麴s。在空氣中易發(fā)生變質(zhì)。易溶于水、乙醇、乙醚、氯仿和石油醚。煙堿能與各種無機酸（如鹽酸、硫酸）和有機酸（如酒石酸、苦味酸）生成結(jié)晶的單鹽和雙鹽，其中雙苦味酸鹽的熔點278℃，常用來鑒別煙堿。煙堿與二氧化汞生成結(jié)晶形復(fù)合物，此反應(yīng)可用來純化煙堿。【1】1.3煙堿的檢測方法1.3.1非水滴定法檢測煙堿含量滴定法煙堿含量是煙草質(zhì)量的重要指標(biāo)，本法分別以鹽酸和水為浸取劑、三氯甲烷為萃取劑、溴甲酚綠和甲基紅的混合試劑為指示劑，在最佳浸取、萃取、ｐＨ值等條件下，用標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液直接滴定煙堿的方法。本法準(zhǔn)確、快速、煙草樣品中,煙堿的測定方法有機溶劑萃取蒸餾酸堿滴定法,在強堿性介簡便。1.3.2紫外分光光度法檢測煙堿含量紫外--可見分光光度法：是根據(jù)物質(zhì)分子對波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。操作簡單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。波長長(頻率小)的光線能量小，波長短(頻率大)的光線能量大。分光光度測量是關(guān)于物質(zhì)分子對不同波長和特定波長處的輻射吸收程度的測量。煙堿(又名尼古丁)是煙草特有的植物堿,它給予吸煙者感官上感覺到“勁頭”而滿意，所以煙堿是煙草質(zhì)量的重要化學(xué)成份之一。過去我們采用經(jīng)典的硅鎢酸沉淀法測定,這個方法準(zhǔn)確性雖高,但化費時間卻很長,每作一個樣品的測定需要30個小時,因此不能適應(yīng)我國煙草工業(yè)形勢發(fā)展的需要,現(xiàn)我們改用紫外分光光度法來測定,其原理是煙堿溶液在特定波長的紫外光源通過時,紫外光量的吸收與煙堿濃度成比例.一個樣品僅需兩小時就可完成測定?！?】1.3.3水蒸氣蒸餾法檢測煙堿含量在堿性條件下將煙草浸泡１２ｈ以上用水蒸氣蒸餾法收集７００～８００ｍＬ蒸出液，即可收集到９５％以上的煙堿，分別用酸堿滴定法和紫外光譜法測定其煙堿含量。1.3.4高效液相色譜法檢測煙堿含量高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論。在技術(shù)上流動相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達(dá)4.9107Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。1.3.5氣相色譜法檢測煙堿含量氣相色譜法的分離原理是利用要分離的諸組分在流。

動相(載氣)和固定相兩相間的分配有差異(即有不同的分配系數(shù))，當(dāng)兩相作相對運動時，這些組分在兩相間的分配反復(fù)進(jìn)行，從幾千次到數(shù)百萬次，即使組分的分配系數(shù)只有微小的差異，隨著流動相的移動可以有明顯的差距，最后使這些組分得到分離。氣相色譜法中有外標(biāo)法、歸一化法、內(nèi)標(biāo)法三種。1.3.5.1外標(biāo)法外標(biāo)法是儀器分析常用的方法之一，是比較法的一種。與內(nèi)標(biāo)法相比，外標(biāo)法不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測組分的含量。外標(biāo)物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。

1.3.5.2歸一化法歸一化法是一種簡化計算的方式，即將有量綱的表達(dá)式，經(jīng)過變換，化為無量綱的表達(dá)式，成為純量。內(nèi)標(biāo)法（internalstandardmethod）是色譜分析中一種比較準(zhǔn)確的定量方法，尤其在沒有標(biāo)準(zhǔn)物對照時，此方法更顯其優(yōu)越性。1.3.5.3內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法是將一定重量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物（參見內(nèi)標(biāo)物條）加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對含有內(nèi)標(biāo)物的樣品進(jìn)行色譜分析，分別測定內(nèi)標(biāo)物和待測組分的峰面積（或峰高）及相對校正因子，按下列公式和方法即可求出被測組分在樣品中的百分含量。1.4檢測方法學(xué)考察1.4.1線性關(guān)系的考察兩個變量之間存在一次函數(shù)關(guān)系，就稱它們之間存在線性關(guān)系。正比例關(guān)系是線性關(guān)系中的特例，反比例關(guān)系不是線性關(guān)系。更通俗一點講，如果把這兩個變量分別作為點的橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)，其圖象是平面上的一條直線，則這兩個變量之間的關(guān)系就是線性關(guān)系。即如果可以用一個二元一次方程來表達(dá)兩個變量之間關(guān)系的話，這兩個變量之間的關(guān)系稱為線性關(guān)系。

1.4.2精密度的考察要求所加工的零件的尺寸達(dá)到的準(zhǔn)確程度,也就是容許誤差的大小,容許誤差大的精密度低,容許誤差小的精密度高;簡稱“精度”,常用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation，SD或S)；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示。分析時，常用RSD表示精密度。也可以簡稱為精度.描述測量數(shù)據(jù)的分散程度。精密度是準(zhǔn)確度得另一個組成部分，而且是它的一個重要的組成部分。精密度是在規(guī)定的條件下，獨立測量結(jié)果間的一致程度。對不同的規(guī)定條件，有不同的精密度的度量。最重要的精密度的度量是重復(fù)性和再現(xiàn)性。【4】

1.4.3重現(xiàn)性實驗的考察在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗。例如，建立獸藥典分析方法時應(yīng)通過不同實驗室的復(fù)核檢驗得出重現(xiàn)性結(jié)果，復(fù)核檢驗的目的、過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗用的樣品本身的質(zhì)量均勻性和貯存運輸中的環(huán)境影響因素，以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。1.4.4吸收率是指投射到物體上而被吸收的熱輻射能與投射到物體上的總熱輻射能之比稱為該物體的吸收率。這是針對所有波長而言，應(yīng)稱為全吸收率，通常就簡稱為吸收率。1.4.5驗證性驗證性實驗是指對研究對象有了一定了解,并形成了一驗證性實驗。定性認(rèn)識或提出了某種假說,為驗證這種認(rèn)識或假說是否正確而進(jìn)行的一種實驗.。驗證性實驗是強調(diào)演示和證明科學(xué)內(nèi)容的活動,科學(xué)知識和科學(xué)過程分離,與背景無關(guān),注重探究的結(jié)果(事實,概念,理論),而不是探究的過程.驗證性實驗證性實驗傳遞了這樣一種信息:了解一個發(fā)現(xiàn)和如何把這個發(fā)現(xiàn)的結(jié)果應(yīng)用到一個確定的問題上比直接學(xué)習(xí)如何發(fā)現(xiàn)要重要得多.驗證性實驗驗證性實驗強調(diào)實驗操作和驗證性實驗觀察等個別智力技能,強調(diào)任何快速經(jīng)濟的獲得生物化學(xué)知識。2實驗部分2.1目的掌握色譜分析基本操作學(xué)會內(nèi)標(biāo)法測定煙堿含量2.2材料和儀器材料98％煙堿(自制備)、喹啉(分析級別)、水（蒸餾水）、進(jìn)樣量為1ul、甲醇（分析級別）2.2.2儀器氣相色譜儀（7890Ⅱ型上海天美公司）、毛細(xì)管柱（30mlengthTM—WAXFrom20℃to260℃）色譜條件氣體流速:N230ml/minAir30ml/minH250ml/min柱箱溫度（OVEN）170℃進(jìn)樣口溫度（INJ）270℃檢測器溫度（DET）270℃2.4實驗設(shè)計及結(jié)果分析通過實驗及對實驗結(jié)果的分析得出以下結(jié)論。線性關(guān)系實驗的考察所用試劑：100ug/mL煙堿甲醇溶液，100ug/mL喹啉甲醇溶液，甲醇（99%以上）配制濃度分別為0、10、20、30、40、50ug/ml的煙堿甲醇溶液，內(nèi)含50ug/ml的喹啉，吸取1ul進(jìn)樣檢測，并記錄煙堿和喹啉的峰面積及峰高，計算出它們之間的峰高比和面積比，結(jié)果見表1。表1：煙堿/喹啉的峰高比及面積比Table1:peakheightratioandarearatioofnicotine/quinoline編號煙堿峰高喹啉峰高峰高比煙堿峰面積喹啉峰面積峰面積比106090017250278188040.08871632201650.0809316881562520.3001435101764420.2466479521930.3625167449590.3376513970224930.621124474528380.46326111916330.6852250445140.5548實驗設(shè)計及結(jié)果分析線性關(guān)系在一定范圍內(nèi)有Y=a+bx用Origin7.5軟件處理峰高比數(shù)據(jù)作圖如下所示：圖1煙堿/喹啉的峰高比Fig.1peakheightratioofnicotine/quinoline以煙堿與喹啉的峰高比為Y軸，以煙堿含量（單位ug）為X軸的回歸方程分別為Y=0.01453X—0.02032(r=0.98738)由此可以看出煙堿含量在0—50ug/ml范圍內(nèi)，采用氣相色譜法測定時其濃度與峰高比呈良好的線性關(guān)系。因為R=0.98738R*R=0.97492Sr=0.0792由t=R/Sr得，t=12.067查表得，t0.01=4.604t0.05=2.776可知t>t0.01為極顯著性用Origin7.5軟件處理面積比數(shù)據(jù)作圖如下：圖2煙堿與喹啉的面積比Fig.2arearatioofnicotine/quinoline以煙堿與喹啉的面積比為Y軸，以煙堿含量（單位ug）為X軸的回歸方程分別為Y=0.01146X—0.00605(r=0.9965)由此可以看出煙堿含量在0—50ug/ml范圍內(nèi)，采用氣相色譜法測定時其濃度與峰面積比呈良好的線性關(guān)系。因為R=0.9965R*R=0.9930Sr=0.0418由t=R/Sr得，t=23.839查表得，t0.01=4.604t0.05=2.776可知t>t0.01為極顯著性線性關(guān)系試驗中，t檢驗峰值比的t=12.067>t0.01，面積比的t=23.839>t0.01，查表t0.01=4.604，說明線性關(guān)系較好。精密度實驗的考察配制濃度為50ug/ml的煙堿甲醇溶液，內(nèi)含50ug/ml的喹啉，取同一支試管中的試液連續(xù)進(jìn)5針，并記錄煙堿和喹啉的峰面積及峰高，計算出它們之間的峰高比和面積比，結(jié)果見表2。表2：精密度試驗Table2：precisionTestuLpeakheightratioarearatioNo.nicotinequinoline15005000.6608650.61439625005000.4590320.46684035005000.5644790.52736945005000.7363660.77758155005000.3545210.324451峰高比S=0.152964RSD%=27.6%面積比S=0.168767RSD%=31.1%2.4.3