辛硫磷對(duì)小鼠遺傳毒性的研究

辛硫磷對(duì)小鼠遺傳毒性的研究

有機(jī)磷農(nóng)藥是目前使用最大的農(nóng)藥。在控制病蟲害的同時(shí)，它不可避免地會(huì)在農(nóng)產(chǎn)品上留下殘留。據(jù)報(bào)道,我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留污染嚴(yán)重,超標(biāo)率遠(yuǎn)高于日本、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家。辛硫磷(phoxim)化學(xué)名稱為O,O-二乙基-O-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯,是一種高效、低毒、擊倒力強(qiáng)、殘留期短的廣譜有機(jī)磷殺蟲劑。隨著甲胺磷等高毒有機(jī)磷農(nóng)藥逐漸被禁止使用,辛硫磷在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用量呈上升趨勢(shì),2005年就達(dá)到百萬(wàn)噸以上。據(jù)報(bào)道,辛硫磷對(duì)雄性哺乳動(dòng)物具有生殖毒性,可造成大鼠精子數(shù)量減少、活動(dòng)度降低,畸形率升高。而關(guān)于其對(duì)哺乳類動(dòng)物遺傳毒性的報(bào)道較為少見。因此,本研究首次采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)與小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)相結(jié)合的方法,評(píng)價(jià)辛硫磷對(duì)小鼠的遺傳毒性,為揭示有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1rad650型酶標(biāo)儀DYCP-31E型水平電泳儀(北京六一儀器廠),E200型熒光顯微鏡(日本尼康公司),BioRad680型酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。辛硫磷(40%乳油,山東東泰農(nóng)化有限公司),瓊脂糖、肝素鈉、臺(tái)盼藍(lán)(0.04%)、溴化乙啶(EB,1μg/ml)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,Tris(臺(tái)灣生工有限公司)。1.2動(dòng)物分組及分組選擇健康SPF級(jí)昆明小鼠60只,體重在20~24g之間,雌雄各半,購(gòu)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物合格證號(hào)為2010-007。實(shí)驗(yàn)室溫度為(25±2)℃,相對(duì)濕度為50%~55%,明暗比為12h∶12h。試驗(yàn)期間,動(dòng)物可自由攝食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后,以辛硫磷對(duì)小鼠半數(shù)致死劑量(LD50)為依據(jù),在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將小鼠隨機(jī)分為6組,分別為陰性對(duì)照(生理鹽水)組和10、20、40、80mg/kg辛硫磷染毒組以及陽(yáng)性對(duì)照組,每組10只,雌雄各半。采用灌胃方式進(jìn)行染毒,染毒容量為10ml/kg,每日1次,連續(xù)染毒14d;而陽(yáng)性對(duì)照組采用腹腔注射方式給予環(huán)磷酰胺(40mg/kg),每日1次,連續(xù)2d。染毒過(guò)程中,定期測(cè)量并記錄小鼠體重。1.3微核試驗(yàn)方法染毒結(jié)束后,將小鼠脫頸椎處死,取下小鼠兩側(cè)股骨,參照史志誠(chéng)等的方法進(jìn)行微核試驗(yàn)。每只小鼠觀察1500個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)含微核的細(xì)胞數(shù),并計(jì)算微核率(微核率=微核細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×1000‰)。1.4細(xì)胞活力及細(xì)胞拖尾率取外周血約0.2ml,加入等量Hanks液充分混勻,將外周血混合液用滴管沿管壁緩慢加入預(yù)先加有0.2ml淋巴細(xì)胞分離液的1ml離心管中,離心后,用毛細(xì)管插到云霧層,吸取淋巴細(xì)胞,用適量PBS將淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整到104~105/ml。采用MTT試驗(yàn)觀察細(xì)胞的存活情況,細(xì)胞的存活率在95%以上。參照1988年Singh等的方法進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)。電泳后,經(jīng)EB染色,用熒光顯微鏡(波長(zhǎng)為515~560nm)觀察。每件樣本隨機(jī)觀察40個(gè)細(xì)胞圖像,每組觀察10件樣本,即每組觀察400個(gè)細(xì)胞,對(duì)DNA損傷的程度進(jìn)行分級(jí),分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為:無(wú)損傷(0級(jí))、輕度損傷(1級(jí))、中度損傷(2級(jí))、重度損傷(3級(jí))、完全損傷(4級(jí))。參照趙影的方法,計(jì)算細(xì)胞拖尾率(細(xì)胞拖尾率=出現(xiàn)拖尾細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)和DNA損傷專用單位。DNA損傷專用單位是一種衡量DNA鏈損傷程度的特有單位,是將不同的分級(jí)加以換算統(tǒng)計(jì),得到DNA損傷的總體水平。其計(jì)算方法:DNA損傷專用單位=(0×0級(jí)細(xì)胞數(shù)+1×1級(jí)細(xì)胞數(shù)+2×2級(jí)細(xì)胞數(shù)+3×3級(jí)細(xì)胞數(shù)+4×4級(jí)細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)。2結(jié)果2.1大鼠體重測(cè)量的結(jié)果表1、2可見,各辛硫磷染毒組雄性、雌性小鼠體重與陰性對(duì)照組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2辛硫磷對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核形成的影響辛硫磷對(duì)雄性和雌性小鼠的微核誘導(dǎo)作用表現(xiàn)出一致性。辛硫磷染毒小鼠骨髓細(xì)胞微核率的變化見表3。表3可見,與陰性對(duì)照組比較,10和20mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率略有升高,但差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;40和80mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠的骨髓細(xì)胞微核率均呈上升趨勢(shì)。說(shuō)明辛硫磷對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生具有誘導(dǎo)作用。辛硫磷染毒小鼠骨髓微核細(xì)胞病理圖見封三圖1。陰性對(duì)照組小鼠骨髓細(xì)胞核為圓形;辛硫磷染毒后小鼠骨髓細(xì)胞形成的微核為圓形或橢圓形,大小在主核的1/5以下,微核的染色深度與主核一致或略淺于主核(封三圖1)。2.3辛硫磷染毒小鼠外周血淋巴細(xì)胞dna損傷的熒光顯微鏡辛硫磷對(duì)雄性和雌性小鼠的DNA損傷作用表現(xiàn)出一致性。辛硫磷染毒對(duì)雄性、雌性小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷的變化分別見表4、5。表4、5可見,各劑量辛硫磷染毒組小鼠外周血淋巴細(xì)胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠外周血淋巴細(xì)胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均呈上升趨勢(shì)。辛硫磷染毒小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷的病理圖見封三圖2。在熒光顯微鏡下,小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA被溴化乙啶染成橘紅色。陰性對(duì)照組小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA呈現(xiàn)規(guī)則圓形的熒光頭部(封三圖2A),拖尾細(xì)胞以1級(jí)損傷(封三圖2B)為主,且拖尾很短。10和20mg/kg辛硫磷染毒組拖尾細(xì)胞數(shù)顯著增多,拖尾細(xì)胞以1級(jí)損傷(封三圖2B)和2級(jí)損傷(封三圖2C)為主,同時(shí),還出現(xiàn)了3級(jí)損傷(封三圖2D)和4級(jí)(封三圖2E)損傷,表明小鼠外周血淋巴細(xì)胞受到的損傷較嚴(yán)重。40和80mg/kg辛硫磷染毒組拖尾細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多,拖尾細(xì)胞以1級(jí)損傷(封三圖2B)、2級(jí)損傷(封三圖2C)和3級(jí)損傷(封三圖2D)為主,同時(shí),4級(jí)損傷細(xì)胞增多(封三圖2E),表明小鼠外周血淋巴細(xì)胞受到的損傷嚴(yán)重。3辛硫磷對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的影響我國(guó)生產(chǎn)的有機(jī)磷農(nóng)藥絕大多數(shù)是殺蟲劑,在農(nóng)業(yè)病蟲害防治上起到了重要作用,但也不可避免地污染了周圍環(huán)境。農(nóng)民噴施農(nóng)藥中毒及人們食用近期噴施農(nóng)藥的蔬菜中毒事件時(shí)有報(bào)道,特別是谷物、水果、蔬菜中殘留的低濃度農(nóng)藥對(duì)人體造成的潛在危害是不容忽視的。這些低濃度農(nóng)藥通過(guò)飲食進(jìn)入人體之后,達(dá)到一定劑量時(shí),就可能在分子水平造成DNA損傷或在細(xì)胞水平引起染色體畸變,而遺傳物質(zhì)的改變與致癌、致畸緊密相關(guān)。辛硫磷是一種高效低毒、廣譜有機(jī)磷殺蟲劑,目前應(yīng)用于防治水稻、小麥、花生、玉米、棉花、蔬菜、果樹、茶、桑等重要農(nóng)作物的害蟲,甚至用于防治倉(cāng)庫(kù)害蟲、衛(wèi)生害蟲和漁業(yè)害蟲,應(yīng)用范圍十分廣泛。辛硫磷的使用量相對(duì)較大,其污染也較為嚴(yán)重。辛硫磷農(nóng)藥在環(huán)境中的殘留是否會(huì)構(gòu)成對(duì)人體健康的危害,一直是學(xué)術(shù)界關(guān)心的環(huán)境安全問(wèn)題。有文獻(xiàn)報(bào)道,辛硫磷可使細(xì)菌基因突變活力增強(qiáng),并影響紫菜DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成。陳賢均等研究發(fā)現(xiàn),高劑量辛硫磷可抑制小鼠骨髓細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)畸變率增高,可見辛硫磷在基因和染色體水平均表現(xiàn)出一定的遺傳毒性。推測(cè)辛硫磷可能導(dǎo)致某些遺傳疾病和癌癥的發(fā)生,具有遺傳毒性。本研究首次采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)與小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)相結(jié)合的方法,評(píng)價(jià)了辛硫磷對(duì)小鼠的遺傳毒性。骨髓細(xì)胞微核率試驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組比較,10和20mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率略有升高,但差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;40和80mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率顯著性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組比較,各劑量辛硫磷染毒組小鼠外周血淋巴細(xì)胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可見,與小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)相比,單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)更加敏感,更適用于檢測(cè)低毒性低濃度農(nóng)藥的遺傳毒性。目前,許多國(guó)家和組織已將小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)作為驗(yàn)證受試物是否具有遺傳毒性的一種標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)試驗(yàn)。本研究的微核試驗(yàn)結(jié)果表明,與陰性對(duì)照組比較,40和80mg/kg辛硫磷染毒組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率顯著性升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠的骨髓細(xì)胞微核率均呈上升趨勢(shì)。趙忠桂等研究發(fā)現(xiàn),農(nóng)滿憶(由氰戊菊酯與辛硫磷混合而成)染毒后,能誘使雄性小鼠睪丸細(xì)胞和SD大鼠骨髓細(xì)胞微核率升高,且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系;劉秀芳等研究發(fā)現(xiàn),辛硫磷染毒雄性小鼠35d后,各染毒組小鼠骨髓細(xì)胞微核率均顯著高于陰性對(duì)照組;且隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠骨髓細(xì)胞微核率呈上升趨勢(shì),并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。這與本研究結(jié)果一致。單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)又稱彗星試驗(yàn),具有很多優(yōu)點(diǎn),與目前已知的各種細(xì)胞水平的致突變測(cè)試方法相比更加敏感,其在農(nóng)藥遺傳毒性研究和安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。本研究的單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果顯示,辛硫磷造成了小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA的損傷,各劑量辛硫磷染毒組小鼠外周血淋巴細(xì)胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且隨著辛硫磷染毒劑量的升高,小鼠外周血淋巴細(xì)胞的拖尾率和DNA損傷專用單位均呈上升趨勢(shì)。周亞莉等研究發(fā)現(xiàn)0.25mg/kg久效磷染毒就可導(dǎo)致小鼠骨髓細(xì)胞微核率顯著升高,外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷程度顯著增加。本研究結(jié)果顯示,40mg/kg辛硫磷染毒即可致小鼠的骨髓細(xì)胞微核率顯著升高,10mg/kg辛硫磷染毒即可引起小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷程度顯著增加。這說(shuō)明辛硫磷對(duì)哺乳動(dòng)物具有遺傳毒性作用,但與高毒有機(jī)磷農(nóng)藥相比,毒性作用相對(duì)較低。綜上所述,辛硫磷對(duì)小鼠具有遺傳毒性,但與高毒有機(jī)磷農(nóng)藥相比,毒性作用相對(duì)較低,其機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步