乳及乳制品的理化檢測(cè)-乳及乳制品中三聚氰胺的測(cè)定

三聚氰胺試紙條快速測(cè)定原理一儀器和設(shè)備二結(jié)果判定四操作方法三注意事項(xiàng)五一、原理

三聚氰胺膠體金速測(cè)卡的檢測(cè)原理是競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析。將著色標(biāo)記物與待測(cè)抗原的特異性抗體(Ab1)相偶聯(lián),沉積在結(jié)合區(qū)。而檢測(cè)區(qū)處固相化的是待測(cè)抗原或待測(cè)抗原的類似物。若樣品中含有待測(cè)抗原,則樣品中的抗原和帶有標(biāo)記物的Ab1形成Ag-Ab1復(fù)合物。隨后在通過固相化有待測(cè)抗原或其類似物的檢測(cè)區(qū)時(shí),由于競(jìng)爭(zhēng)抑制,不再發(fā)生反應(yīng),檢測(cè)線處不顯色;樣品繼續(xù)前移,Ag-Ab1復(fù)合物被固相化在質(zhì)控線處的抗Ab1抗體(Ab2)所結(jié)合,形成Ab1-Ag-Ab2復(fù)合物,使質(zhì)控線顯色。高效液相色譜法二、儀器和設(shè)備三聚氰胺膠體金速測(cè)卡等高效液相色譜法三、操作方法高效液相色譜法1．將未開封的試紙卡和檢測(cè)樣品恢復(fù)至室溫。2．將試紙卡水平放置，用滴管向試紙卡孔緩慢逐滴加入3滴不含氣泡的待測(cè)液3．5分鐘判斷結(jié)果，10分鐘后的結(jié)果僅作參考。四、結(jié)果判斷高效液相色譜法陰性：C線顯色，T線肉眼可見，無論顏色深淺均判為陰性。陽性：C線顯色，T線不顯色，判為陽性。無效：C線不顯色，無論T線是否顯色，該試紙均判為無效。圖1結(jié)果顯示圖五、注意事項(xiàng)高效液相色譜法1．如果購買時(shí)發(fā)現(xiàn)過期，破損，污染，無效的產(chǎn)品，請(qǐng)?jiān)谫徺I處進(jìn)行更換。2．所有試紙啟封后1小時(shí)內(nèi)使用。高效液相色譜法

乳制品中三聚氰胺的測(cè)定原理一試劑和材料二分析步驟四儀器和設(shè)備三高效液相色譜測(cè)定五一、原理

試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法測(cè)定。高效液相色譜法二、試劑和材料除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。甲醇：色譜純乙腈：色譜純氨水：含量為25％～28％三氯乙酸檸檬酸辛烷磺酸鈉：色譜純甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50mL甲醇和50mL水，混勻后備用。三氯乙酸溶液（1％）：準(zhǔn)確稱取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。高效液相色譜法二、試劑和材料高效液相色譜法氨化甲醇溶液（5％）：準(zhǔn)確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。離子對(duì)試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980mL水溶解，調(diào)節(jié)PH至3.0后，定容至1L備用。三聚氰胺標(biāo)品：CAS08-78-01，純度大于99.0％三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取100mg（精確到0.1mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品與100ml容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。陽離子交換固相萃取柱：基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，填料質(zhì)量為60mg，體積為3mL，或相當(dāng)者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。定性濾紙海砂：化學(xué)純，粒度0.65mm～0.85mm，二氧化硅（SiO2）含量為99％微孔濾紙：0.2微米，有機(jī)相氨氣：純度大于等于99.999％三、儀器和設(shè)備高效液相色譜（HPLC）儀：配有紫外線檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器分析天平：感量為0.0001g和0.01g離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min超聲波水域固相萃取裝置氨氣吹干儀渦旋混合器具塞塑料離心管：50mL研體高效液相色譜法四、分析步驟高效液相色譜法提取液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等

稱取2g（精確至0.01g）試樣于50mL具塞塑料離心管，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲提取10min,在震蕩提取10min后，以不低于4000r/min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后做待凈化液。四、分析步驟高效液相色譜法提取奶酪、奶油和巧克力等

稱取2g（精確至0.01g）試樣于研缽中，加入適量海砂（試樣質(zhì)量的4倍～6倍）研磨成干粉狀，轉(zhuǎn)移至50mL具塞塑料離心管中，用15mL三氯乙酸溶液分?jǐn)?shù)次清洗研缽，清洗液轉(zhuǎn)入離心管中，在往離心管中加入5mL乙腈，余下操作同液態(tài)奶提取“超聲提取10min加入5mL水混勻后做待凈化液”。

注：若樣品中脂肪含量較高，可以利用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。四、分析步驟高效液相色譜法凈化

將提取液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。一次用3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脫。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1mL/min。洗脫液于50℃下用氨氣吹干，殘留物（相當(dāng)于0.4g樣品）用1mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜后，供HPLC測(cè)定。五、高效液相色譜測(cè)定高效液相色譜法HPLC參考條件色譜柱：C8柱，250×4.6[內(nèi)徑（i.d.）]，5μm或相當(dāng)者。

C18柱，250×4.6[內(nèi)徑（i.d.）]，5μm或相當(dāng)者。流動(dòng)相：C8柱，離子對(duì)試劑緩沖液-乙腈（85+15，體積比），混合。

C18柱，離子對(duì)試劑緩沖液-乙腈（90+10，體積比），混合。流速：1.0mL/min柱溫：40℃波長(zhǎng)：240nm進(jìn)樣量:20μL五、高效液相色譜測(cè)定高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程?；|(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品HPLC色譜圖參見圖A.1五、高效液相色譜測(cè)定高效液相色譜法定量測(cè)定待測(cè)樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。結(jié)果計(jì)算試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計(jì)算獲得：

X

試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）A

樣液中三聚氰胺的峰面積C

標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）V

樣液最準(zhǔn)定容體積，單位為毫升（mL）A5

標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積m

試樣的質(zhì)量，單位為克（g）f

稀釋倍數(shù)。高效液相色譜法

空白實(shí)驗(yàn)除不稱取樣品