芽孢桿菌的分離及芽孢桿菌制劑的制備

芽孢桿菌的分離及芽抱桿菌制劑的制備［實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙螅菡莆昭勘U菌的分離方法，熟悉芽抱桿菌的分離原理。掌握芽抱桿菌制劑的制備技術(shù)。［實(shí)驗(yàn)原理］芽抱桿菌的分離原理利用芽抱桿菌以芽抱形式存在時(shí)具有耐高溫的特點(diǎn)，將樣品于80^高溫處理20min,消滅其它菌株，然后再分離芽抱桿菌。［實(shí)驗(yàn)器材］水浴鍋、土壤、各種培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板、三角棒、250mL三角瓶、移液管、滅菌生理鹽水、試管等。［實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法］芽抱桿菌的分離⑴實(shí)驗(yàn)步驟取0.5g土壤于3mL裝有滅菌生理鹽水的無菌試管中，振蕩混勻。將樣品置80^水浴鍋中處理20min。取1接種環(huán)樣品于營養(yǎng)瓊脂平板上按分區(qū)劃線法進(jìn)行劃線，37°C培養(yǎng)20?24h。取出培養(yǎng)平板，觀察菌落特征。挑取單個(gè)菌落，涂片、革蘭染色、鏡檢，觀察是否形成芽抱。將鏡檢有芽抱的單菌落進(jìn)行傳代、純化、保存?zhèn)溆?。⑵結(jié)果分離的芽抱桿菌革蘭染色為革蘭陽性、能形成芽抱的大桿菌?？诜脱勘U菌制劑的制備⑴培養(yǎng)基的配制固體培養(yǎng)基葡萄糖20g/L、蛋白胨15g/L、NaCl5g/L、KH2PO42g/L、K2HPO4-3H2O4g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，121C滅菌20min。搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖20g/L、蛋白胨15g/L、NaCl5g/L、KH2PO42g/L、K2HPO4-3H2O4g/L，pH7.0,121C滅菌20min。優(yōu)化培養(yǎng)基葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、NaCl5g/L、KH2PO42g/L、K2HPO4-3H2O4g/L、MnSO40.4g/L、MgSO4?7H2O2g/L,pH7.0,121°C滅菌20min。⑵發(fā)酵一級發(fā)酵取一環(huán)活化的菌種，接入裝液量為100mL的搖瓶培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，37C,160r/min培養(yǎng)24h。二級發(fā)酵吸取10mL一級發(fā)酵種子液，接入裝液量為100mL的搖瓶培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中（接種量10%,V/V）,37C,160r/min培養(yǎng)18-24h。⑶分裝將檢驗(yàn)合格的菌液進(jìn)行分裝。⑷檢驗(yàn)雜菌的檢驗(yàn)取發(fā)酵后的菌液進(jìn)行涂片、革蘭染色及鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)染色特點(diǎn)。雜菌不得超過1000個(gè)/mL。活菌數(shù)檢測將發(fā)酵后的菌液涂片、鏡檢觀察,（接種環(huán)應(yīng)封口，直徑約0.5cm，沾菌涂布約直徑0.5-1cm大小面積）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：油鏡下各視野平均細(xì)菌值為1-9個(gè)細(xì)菌，等于105-6/mL。油鏡下各視野平均細(xì)菌值為10-99個(gè)細(xì)菌，等于107-8/mL。油鏡下各視野平均細(xì)菌值為100以上個(gè)細(xì)菌，等于109」0/mL。油鏡下各視野平均細(xì)菌值為密集細(xì)菌，等于1010以上/mL。芽抱桿菌制劑活菌數(shù)：不少于108個(gè)/mL。凍干型芽抱桿菌制劑的制備⑴培養(yǎng)基的制備5.5%豆餅粉、6.5%玉米粉，1%蛋白胨，0.5%氯化鈉，ddH2O1000mL，121C高壓滅菌30min。⑵發(fā)酵按1%接種量接種菌液于上述高壓后的培養(yǎng)基中，混勻，裝入托盤厚度2cm，28-35C無菌好氧發(fā)酵48?72h，檢測發(fā)酵后活菌含量，再用玉米粉調(diào)節(jié)至含菌10