廣西大學(xué) 高級生物化學(xué)課件- 重組DNA技術(shù)-2

重組DNA技術(shù)RecombinantDNATechnology姜伯樂第一節(jié)概述

DNA克隆(DNAcloning)：應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子—復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子的過程。DNA克隆又稱基因克?。╣enecloning）。

基因工程（geneticengineering）：實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作。又稱重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）一、克隆體系：目的基因、載體DNA、工具酶、宿主細(xì)胞等

1、目的基因（targetgene）：cDNA或基因組DNA

2、載體(vector)：質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒載體、病毒和人工染色體等

cDNA（complementaryDNA）：指體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的，與RNA（常指mRNA）互補(bǔ)的單鏈DNA,單鏈cDNA進(jìn)而合成雙鏈cDNA。基因組DNA（genomicDNA）：代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列，稱為基因組DNA。質(zhì)粒（plasmid）：存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，在細(xì)胞中可以獨立進(jìn)行復(fù)制并在細(xì)胞分裂時恒定地傳給子代細(xì)胞。3.1限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease):存在于細(xì)菌體內(nèi)，能夠識別和切割雙鏈DNA內(nèi)部特定核苷酸序列的一類核酸酶。

3、工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、堿性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶，等

常用的是II類限制性內(nèi)切酶

許多限制性核酸內(nèi)切酶II的識別序列屬于回文結(jié)構(gòu)配伍末端（compatibleend）：不同限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的相同粘性末端

3.2DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）、Klenow片段(Klenow

酶)、T4DNA聚合酶以及Taq酶等

3.3DNA連接酶T4連接酶：可用于粘端與平端的連接

4、宿主細(xì)胞：大腸桿菌、酵母、動物細(xì)胞

?

DH5α,JM109(RecA1,endA1,gyrA96,thi,supE44,relA1,△(lac-proAB)/F’[traD36,lacIq,lacZ

△M15])?M15?

INVSc1(MATahis3Δ1leu2trp1-289ura3-52/MATαhis3Δ1leu2trp1-289ura3-52),Phenotype:His-,Leu-,Trp-,Ura-第二節(jié)DNA克隆的基本過程

分、切、接、轉(zhuǎn)、篩、表達(dá)一、“分”：目的基因及載體的制備

1、分離基因的方法：化學(xué)合成、PCR、基因組文庫、cDNA文庫

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）：在反應(yīng)體系中加入模板DNA、dNTP、特別設(shè)計的特異引物及耐熱的DNA聚合酶（常用Taq酶），經(jīng)多次變性、退火、延伸循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA呈指數(shù)合成的過程

cDNA文庫(cDNAlibrary)：以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了所有cDNA信息，總稱cDNA文庫。常用于篩選編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因?；蚪MDNA文庫(genomicDNAlibrary)：利用限制性核酸內(nèi)切酶將組織或細(xì)胞染色體DNA切割后，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了所有基因組DNA信息，總稱基因組DNA文庫

2、常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA

克隆載體（cloningvector）：用于目的基因的克隆、擴(kuò)增、序列分析和體外定點突變等pUC19,pK18mob…表達(dá)載體(expressionvector)：用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源目的基因，獲得大量表達(dá)產(chǎn)物

pQE30,pYES2…二、“切”：限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體DNA

三、“接”：重組體的構(gòu)建

四、“轉(zhuǎn)”：重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化（transformation）：將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入宿主細(xì)胞(常用大腸桿菌)，并使其獲得新的表型的過程

2、轉(zhuǎn)染（transfection）：將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程

3、感染（transfection）：以l噬菌體、柯斯質(zhì)粒和病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）

五、“篩”：篩選出含重組DNA的受體細(xì)胞

1、直接選擇法：遺傳標(biāo)記【抗藥性標(biāo)志選擇、營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)篩選法及分子標(biāo)記（PCR、分子雜交）】

2、非直接選擇法：免疫化學(xué)法、酶聯(lián)免疫檢測法

六、“表達(dá)”：使克隆基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)

1、外源基因在原核細(xì)胞的表達(dá)

大腸桿菌是最常用的原核表達(dá)體系

真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體

2、真核表達(dá)體系：酵母、昆蟲及哺乳動物細(xì)胞等

突變方法插入突變（轉(zhuǎn)座子）整合突變（自殺質(zhì)粒）缺失突變點突變定點突變隨機(jī)突變：插入突變細(xì)菌轉(zhuǎn)座子：插入序列（Insertionsequences）

復(fù)合轉(zhuǎn)座子（Compositetransposons）

TnA轉(zhuǎn)座子家族（TnAfamlily）

可轉(zhuǎn)移噬菌體（Muphage）Tn5gusA5EZ-Tn5DistributionofTn5gusA5inthegenome（partial）ConfirmationofTAIL-PCRdeterminedtransposonpositionbyPCRORF2ORF2gusAIS50RKanORF1ORF3PredictedsizeofPCRproductUPDPIS50RSPM123456789101112131415161718192021222324gusASPPredictedsizeofPCRproductM:DNAmarker(100bp)；1~24:PCRproductsStrategyofpK18mobintegrationmutagenesisPhysicalmapofpK18mobNonpolargeneinactivationbysinglesiteintegrationofahomologousplasmidPlacKanlacZTargetORFpK18mobchromosomePlacKanlacZPartialseqofORFchromosomemutantPlacKanlacZDownstreamORFSPPCRGelanalysisMutantcomfirmationPfuAmplificationoftruncatedfragmentsoftargetORFDigestionofpK18mobwithSmaIT4DNALigaseElectro-transformationScreeningandconfirmationTri-parentsconjugationScreeningandconfirmationMutantspreservationATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGG

GATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT平連ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC3n(3n+2)酶連ATGATTACGAATTC3n+1(3n+2)引物設(shè)計注意事項5’端整合突變體驗證StrategyofpK18mobSacBdeletionmutagenesissacBgeneBacillussubtilis(枯草桿菌)sacBgenethatencodeslevansucrase

(蔗糖-6-果糖基轉(zhuǎn)移酶)

isaparticularlyusefultoolsinceitprovidesapositiveselectionfortherecombinationevent.Encodinglevansucrase(Lepesantetal.,1974),itsexpressionisinhibitorytothegrowthofmanyGram-negativeandgram-positivebacteriainthepresenceofsucrose(Gayetal.,1985;RiedandCollmer,1987;Kanigaetal.,1991;Jageretal.,1995;Pelicicetal.,1996)ABCDpK18mobSacB整合1st整合2nd整合LeftflankRightflankpT18mobGmLeftflankRightflank8004genomeAmplifiedfrompPH1JIKpnIBamHIXbaIEcoRI缺失突變技術(shù)路線TargetORF缺失突變技術(shù)路線1、取旁側(cè)序列(1.5kb）2、設(shè)計旁側(cè)引物和Gm引物

(EcoRI,KpnI,BamHI,XbaI,PstI,HindIII)3、擴(kuò)增旁側(cè)和Gm片段4、酶切載體、旁側(cè)和Gm片段5、四片段連接，轉(zhuǎn)化，Tc,Gm,IPTG,X-Gal篩選6、以兩外側(cè)引物擴(kuò)增驗證和酶切驗證7、陽性克隆三親導(dǎo)入Xcc8004，Rif,Gm篩選8、篩選Tc敏感接合子9、PCR驗證（8004、Tcr、Tcs）概述1973，Cohen等人首次使用DNA克隆技術(shù)成功一、克隆與克隆化克隆即指同一副本或拷貝（copy）的集合；獲取同一拷貝的過程叫克隆化?！緦嵗扛谓M織

分離肝實質(zhì)細(xì)胞

單一肝實質(zhì)細(xì)胞繁殖----------細(xì)胞克隆自眾多分子中分離獲得相同分子，即為分子克隆，在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域所談的分子克隆專指DNA克隆.一、質(zhì)粒的特點：

1、環(huán)狀DNA，2kb～數(shù)百kb。

2、某些質(zhì)?？梢灾亟M到染色體中復(fù)制，形成附加體。質(zhì)粒載體

3、質(zhì)粒的遺傳信息可以賦予細(xì)胞某些性狀（抗藥性等），這些形狀的有無常用于鑒定質(zhì)粒是否存在于活細(xì)胞中。

4、質(zhì)粒復(fù)制分兩型——嚴(yán)謹(jǐn)型、松弛型

松弛控制性質(zhì)粒，拷貝數(shù)多，不受細(xì)胞內(nèi)染色體控制。5、質(zhì)粒含易位子和易位現(xiàn)象。易位子是質(zhì)粒上的特定DNA序列，它可以從所在質(zhì)粒易位于其它質(zhì)粒或染色體中，它對細(xì)菌的進(jìn)化有意義。質(zhì)粒載體

嚴(yán)謹(jǐn)控制型質(zhì)粒，拷貝數(shù)少，復(fù)制受染色體控制。質(zhì)粒載體理想載體的條件：

1、具有自主復(fù)制能力；

2、具有較多的拷貝數(shù)，易與宿主細(xì)胞的染色體DNA分開；

3、分子量相對較小，能夠容納目的基因；

4、具有較多單一限制性內(nèi)切酶位點；

5、有一個或多個篩選標(biāo)記；

6、具有較高的遺傳穩(wěn)定性。TheconstructedplasmidpBR322

質(zhì)粒載體外源基因插入位點EcoRⅠ含一個復(fù)制起始點（ori）抗藥基因terr和ampr1977年由Boliver等人自E.coli的天然質(zhì)粒建成。1、克隆載體常用克隆載體AnexampleofanE.coliexpressionvector質(zhì)粒載體2、表達(dá)載體外源基因插入位點復(fù)制起始點（ori）標(biāo)記基因啟動子調(diào)控序列核蛋白體結(jié)合序列常用表達(dá)載體E.coliYeast噬菌體載體

常用噬菌體：噬菌體載體、M13噬菌體1、噬菌體載體（1）結(jié)構(gòu)：線性雙鏈DNA，由三個片段組成（左臂、中央、右臂）；感染細(xì)菌后，可以形成封閉環(huán)分子。（2）兩類載體置換型載體：適于基因組DNA克隆。插入型載體：適于cDNA克隆。其它類型載體

一、柯斯質(zhì)粒（cosmid）二、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體三、Ti質(zhì)粒

可重組45kb的大片段

適用于動物細(xì)胞的基因工程

用于植物細(xì)胞基因工程http://www.dsmz.de/microorganisms/plasmid_info.php?dsmz_no=6305

pLAFR1,pLAFR3,pLAFRJ,pLAFR6SacIKpnIDNASeq.2004Jun;15(3):225-7.GeneticandphysicalmapofthepLAFR1vector.VanbleuE,MarchalK,VanderleydenJ.CentreofMicrobialandPlantGenetics,KatholiekeUniversiteitLeuven,KasteelparkArenberg20,3001Heverlee,Belgium.AbstractThispaperpresentsthecompletesequencingandannotationofthepLAFR1vector.pLAFRisatetracycline-resistant"cosmid"cloningvector,whichisderivedfromthe20kbplasmidpRK290,aRK2-derivative.Duetoitsbroadhostrange,thepLAFR1vectorhasbeenwidelyusedinthegeneticanalysisofabroadnumberofgram-negativebacterialspecies.TheavailabilityofthecompletepLAFR1sequencewillmostdefinitelyhelpintheconstructionandanalysisofclonelibraresbasedonpRK290orpLAFRvectors.TCTAGAGGATCCCCGGGTGGTCAGTCCCTTATGXbaIBamH

ISmaIFromClontechcatalogue1996/97NOS-ProNPTII(Kan)NOS-terCaMV35SpromoterXbaIBamHISmaIβ-glucuronidaseNOS-terRBLBpBI121ATGTGAPstISphIHindIIIPstIPstISphISphIEcoRITCTAGAGGATCCCCGGGTGGTCAGTCCCTTATGXbaIBamH

ISmaIFromClontechcatalogue1996/97NOS-ProNPTII(Kan)NOS-terCaMV35SpromoterXbaI5816BamHI5822SmaI5829β-glucuronidaseNOS-terRBLBpBI12114758bpATG5845TGA7656PstISphIHindIIIPstIPstISphISphIEcoRI798377277979SacI771628383632

25192825245424784022427749745808nptII:2901-3629T-NOS:4022-4277CaMV35S:4974-5808GUS:5845-7656T-NOS:7727-7979RB:8621-8646RB:2454-2478P-NOS:2519-2825Kan:2838-363286218646其它類型載體

四、酵母人工染色體（YAC）一、限制----修復(fù)體系（restriction-modificationsystem）在細(xì)菌中與限制性內(nèi)切酶同時共存有一種甲基化酶，兩種酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制--修飾體系內(nèi)切酶：切除限制外源DNA甲基化酶：保護(hù)自身DNA限制性核酸內(nèi)切酶二、限制性內(nèi)切酶分類：依據(jù)酶的組成、所需輔助因子及裂介方式分為三類1、三個亞基組成的限制酶即有內(nèi)切酶又有甲基化酶活性需ATP供能輔助因子：Mg2+,S腺苷甲硫氨酸切割：特異性差，切割識別位點約400-700bp或更遠(yuǎn)的DNA。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶即有內(nèi)切酶又有甲基化酶活性需ATP供能輔助因子：Mg2+切割：識別位點周圍25-27bp內(nèi)2、兩個亞基組成的限制酶

3、一個亞基的限制酶：常稱作限制性內(nèi)切酶只有內(nèi)切酶活性，無甲基化酶活性不需ATP供能輔助因子：Mg2+切割：特異位點內(nèi)酶識別序列結(jié)構(gòu)呈二元旋轉(zhuǎn)對稱又叫作回文結(jié)構(gòu)(palindrome)限制性核酸內(nèi)切酶【經(jīng)典舉例】EcoRI5’端---GAATTC---3’端3’端---CTTAAG---5’端TheinteractionofEcoRIendo-nucleasewithitstargetsequence.Thedimericenzyme(withitstwosubunitsingrayandlightblue)isshownboundtoDNA.InthetopviewtheDNAbindingsiteisfacingtheviewer.InthebottomviewtheboundDNAisfacingawayfromtheviewerandisnotvisible.限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物：具有5’磷酸基和3’羥基基團(tuán)由于酶的作用不同可以產(chǎn)生三種切割末端。（1）5’突出末端：如EcoRI5’端---GAATTC---

3’端3’端---CTTAAG---5’端5’AATTC---3’3’G---5’5’---

G

3’3’---CTTAA5’

酶識別DNA序列的長短不同，一般為4-18bp（3）平頭鈍性末端：如HpaI限制性核酸內(nèi)切酶5’端---GTTAAC---3’端3’端---CAATTG---5’端5’---GTT3’3’---CAA5’5’AAC---3’3’TTG---5’（2）3’突出末端：如PstI5’端---CTGCAG---

3’端3’端---GACGTC---5’端5’---CTGCA3’3’---G5’5’G

---

3’3’ACGTC---5’工具酶

功能

限制性內(nèi)切酶

識別特異序列、切割DNA

DNA連接酶

連接DNA片段

DNA聚合酶I

合成DNA

反轉(zhuǎn)錄酶

合成cDNA

多聚核苷酸激酶

催化多聚核苷酸5

末端磷酸化

末端轉(zhuǎn)移酶

在3

羥基