蛋白質(zhì)的表達純化及結(jié)晶

2?3?2?2蛋白質(zhì)表達、純化初始種子培養(yǎng)：挑取陽性克隆到10mL的含有Amp抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，在37°C過夜振蕩培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)：將初始種子接XL含抗生素的液體培養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)至菌濃0D600為0.6-0.8時，降溫至15C或20C；一個小時后加入終濃度為0.6mM的IPTG,并誘導(dǎo)表達過夜。收集菌體：于4200rpm，4C下離心15min，棄去上清，收獲菌體；加入重懸溶液(25mMTris-HClpH8.0，100mMNaCl)，懸浮菌體細胞；細胞破碎前加入終濃度為2mM的蛋白酶抑制劑PMSF(Phenylmethylsulfonylfluoride，苯甲酸磺酰氟)。超聲破碎細胞：400W下，超聲3s，間隔6s，工作60次。超速離心：細胞裂解液于14000rpm，4C下離心50min，收集上清液，進行下一步的分離純化。Ni-NTA親和層析：將上清液體倒入Ni-NTA柱中。流凈后，用washbuffer(25mMTris-HClpH8.0，100mMNaCl，15mMimidazole)沖洗10個柱體積，除去雜蛋白；最后使用elutionbuffer(25mMTris-HClpH8.0，100mMNaCl，250mMimidazole)將目的蛋白洗脫下來。使用SDS檢測蛋白的可溶性、掛柱效率及蛋白的濃度。由于本實驗中YdiV等蛋白都是連接^0pGl01載體中，帶有可以用PPase切除的6xHis標簽。為了獲得更純凈的、不帶標簽的蛋白，我們在有那個washbuffer沖洗去除雜蛋白以后，每根鎳柱中加入5ml的重懸緩沖液然后加入100-200“I的PPase，3-5h后，用5ml重選沖洗柱子，電泳檢測酶切效率。陰離子交換層析純化：先平衡離子交換柱。然后將上一步洗脫下的蛋白用溶液A(25mMTris-HCl,pH8.0)稀釋4-6倍，上樣到離子交換柱SourceQ上，使用溶液A與溶液B(25mMTris-HClpH8.0，1MNaCl)進行線性梯度洗脫。收集各個出峰位置(根據(jù)280nm的吸光值)附近的收集管。進行SDS電泳，檢測目的蛋白質(zhì)出峰位置、純度和濃度。超濾濃縮：將含有目的蛋白的洗脫液用超濾杯濃縮到2ml。分子篩柱層析純化：注射上樣到已經(jīng)用溶液C(10mMTris-HCl,pH8.0,100mMNaCl)平衡好的凝膠過濾層析柱Superdex200上。用溶液C進行洗脫。出鋒位置與蛋白的大小以及形狀相關(guān)。收集蛋白峰進行SDSfe泳,檢測蛋白質(zhì)的純度及性狀。所有的蛋白純化步驟均在4°C進行。最后，將濃度在5-10皿她左右、較為純凈的蛋白用液氮速凍，分裝并保存在-80C冰箱。2.3.2.4蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)本實驗室一般使用坐滴法對蛋白質(zhì)進行晶體的初篩，篩選得到晶體后，利用懸滴法對蛋白質(zhì)晶體進行優(yōu)化。蛋白樣品的準備將純化好的蛋白質(zhì)樣品于水上融化，并于4°C12,000rpm離心5min。結(jié)晶普篩試劑盒使用Hampton公司的Index1-96、Crystalscreen、CrystalscreenII、SaltRx、WizardI、WizardII、Wizardlll、PEGion、PEGRx-1、PEGRx-2和Natrix約600個條件進行晶體生長的初篩。蛋白與池液各1但混合。晶體優(yōu)化過程完成晶體初篩后，3天或7天后可觀察結(jié)晶情況。對于有晶體的條件(通過顯微鏡觀察、晶體染色和晶體溶解跑SDS電泳來確認是蛋白質(zhì)晶體)使用懸滴法優(yōu)化以獲得單晶性更好、更大的蛋白質(zhì)晶體。優(yōu)化結(jié)晶條件可以使用以下幾種方法：在初篩最佳晶體條件附近對pH、沉淀劑濃度和鹽濃度進行微調(diào)；加入添加劑(additive)或者表面活性劑(detergent)來優(yōu)化晶體；嘗試不同的結(jié)晶溫度；種晶(seeding)。對于衍射不太好的、較大個的晶體，還可以嘗試脫水、退火等結(jié)晶后操作來獲得較高分辨率的數(shù)據(jù)。2.3.2.5蛋白質(zhì)晶體衍射及數(shù)據(jù)收集通過晶體學(xué)的方法，可以從衍射的強度求出晶胞中所有原子的位置；對于蛋白質(zhì)晶體而言，它是由蛋白質(zhì)分子或者分子集團在空間規(guī)則排列形成的，這些重復(fù)的單元組成了晶胞；所以知道了晶胞里所有原子的位置，也就知道了蛋白質(zhì)分子中所有原子的位置，也就知道了蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)。蛋白晶體的結(jié)構(gòu)信息包含于衍射的結(jié)構(gòu)因子Fhkl中。要得到完整的結(jié)構(gòu)信息，必需收集足夠的衍射數(shù)據(jù)，即收集各個角度的衍射數(shù)據(jù)。在對晶體數(shù)據(jù)進行收集之前，需要先對晶體衍射質(zhì)量進行預(yù)實驗，選取衍射質(zhì)量較好的晶體進行低溫冷凍，然后利用同步輻射光源進行數(shù)據(jù)收集工作?！巴捷椛?/p>