微生物實(shí)驗(yàn)真菌

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.病例四總結(jié)2.新隱墨汁負(fù)染3.真菌培養(yǎng)法、真菌菌落、菌絲（示教）4.真菌皮屑試驗(yàn)（操作，每組一份）5.支原體、衣原體包涵體，恙蟲(chóng)病立克次體觀察6.病例五、六、七的討論病例四患者，女性，43歲，體重45kg。于2012年11月19日受涼后出現(xiàn)頭痛，為持續(xù)性頭部脹痛，伴有視力下降，視物模糊而入院。病史：患者曾自行口服感冒清熱顆粒3d癥狀無(wú)好轉(zhuǎn)，遂就診于某市級(jí)醫(yī)院以顱內(nèi)感染進(jìn)行抗病毒治療，亦未見(jiàn)好轉(zhuǎn)。入院查體：體溫37℃，脈搏88次/min，呼吸20次/min，血壓126/90mmHg；神清語(yǔ)利，雙側(cè)瞳孔等大等圓，對(duì)光反射消失，頸項(xiàng)強(qiáng)直，布氏征（＋），余內(nèi)科檢查無(wú)特殊發(fā)現(xiàn)。頭顱CT以及腦血管造影無(wú)特殊改變。眼底檢查見(jiàn)視乳頭水腫。實(shí)驗(yàn)室檢查：腦脊液（CFS）壓力250mmHg，腦脊液（CSF）白細(xì)胞總數(shù)130×106個(gè)/Ｌ。入院進(jìn)行腦脊液生化檢查：糖定量0.3mmol/L，蛋白定量1.65g/L，氯化物定量113.5mmol/L。腦脊液涂片檢查：抗酸染色（-），革蘭染色未發(fā)現(xiàn)革蘭陰性成對(duì)排列球菌，墨汁染色（＋）?；颊呷朐汉蟪霈F(xiàn)惡心、嘔吐、發(fā)熱等不適，結(jié)合臨床復(fù)查各項(xiàng)指標(biāo)后，隱球菌性腦膜炎診斷明確。既往史：既往體健，否認(rèn)鳥(niǎo)類接觸史，否認(rèn)有結(jié)核、傷寒、菌痢、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）等傳染病史。附臨床檢驗(yàn)正常參考值：腦脊液檢查：壓力90-180mmHg，白細(xì)胞總數(shù)（WBC）0～8×106／L，其中LC：MC為7：3，蛋白含量0.05-0.45g/L，糖含量2.5-4.5mmol/L，氯化物含量120-130mmol/L。該患者患有什么疾??？如何進(jìn)行微生物學(xué)檢查？診斷思路：腦膜刺激征、腦脊液壓力、白細(xì)胞、蛋白、糖氯化物腦內(nèi)化膿菌感染？結(jié)核菌？真菌？鴿場(chǎng)附近初診：新生隱球菌感染？腦脊液抗酸染色陰性、革蘭染色未發(fā)現(xiàn)腦膜炎奈瑟菌、LC：MC取標(biāo)本：腦脊液腦脊液墨汁染色新生隱球菌墨汁染色原理：負(fù)染方法：

1.玻片上滴加已與精致墨汁混勻的病人腦脊液標(biāo)本；

2.加蓋玻片；

3.低倍鏡檢。結(jié)果：

1、圓形或卵圓形菌體2、芽生孢子。3、莢膜。

新生隱球菌墨汁染色菌體莢膜

分離培養(yǎng)鑒定：沙保弱培養(yǎng)基尿素酶試驗(yàn)：陽(yáng)性含有二酚底物的培養(yǎng)基上，由于具有酚氧化

酶，在胞壁中產(chǎn)生黑色素，使菌落呈黑色抗原檢查：膠乳凝集試驗(yàn)，腦膜炎患者陽(yáng)性

率可達(dá)90%真菌示教1.真菌培養(yǎng)法：大培養(yǎng)法、小培養(yǎng)法2.真菌的菌落：酵母菌、白色念珠菌、石膏樣小孢子菌3.真菌的孢子和菌絲：石膏樣小孢子菌、青霉菌、白假絲酵母菌真菌培養(yǎng)法大培養(yǎng)法

1、用途：形態(tài)、色素。

2、方法：（1）沙保弱斜面培養(yǎng)基（2）接種，石蠟封閉管口棉塞（3）22～28℃培養(yǎng)。（4）1周后觀察。小培養(yǎng)法（小瓷片培養(yǎng)法）

1、用途：觀察絲狀菌不同發(fā)育階段及完整的基本結(jié)構(gòu)

2、方法：（1）小瓷片的制備（2）裝沙保弱培養(yǎng)基、接種真菌（3）培養(yǎng)觀察：22-28℃真菌的菌落1.酵母型菌落2.類酵母型菌落3.絲狀菌落4.二相性菌落真菌的菌落1、酵母型菌落：

圓形、較大、白色、表面光滑濕潤(rùn)、無(wú)菌絲長(zhǎng)入培養(yǎng)基內(nèi)，類似一般細(xì)菌菌落。2、類酵母型菌落：

圓形、較大、白色、表面中間粗糙、起皺，假菌絲侵入培養(yǎng)基內(nèi)。3、絲狀菌落：

大都有氣生菌絲、呈絨毛狀、粉狀、棉花樣等，色澤多種多樣，菌落底部有營(yíng)養(yǎng)菌絲長(zhǎng)入培養(yǎng)基內(nèi)。真菌的菌落真菌的孢子葉狀孢子分生孢子孢子囊孢子新生隱球菌酵母型菌落：沙保弱培養(yǎng)基，室溫/37℃，2-5天，乳白色、不規(guī)則酵母型菌落，表面蠟樣光澤鏡檢：圓形或卵圓形菌體，厚膜孢子，芽生孢子，有時(shí)也可見(jiàn)到芽管石膏樣小孢子菌的大分生孢子體積較大由多個(gè)細(xì)胞組成呈梭狀內(nèi)有間隙由生殖菌絲末端的細(xì)胞分裂或收縮形成青霉菌的小分生孢子體積較小一個(gè)孢子只有一個(gè)細(xì)胞呈掃帚狀菌絲有間隙由生殖菌絲末端的細(xì)胞分裂或收縮形成白假絲酵母菌孢子和假菌絲革蘭染色陽(yáng)性著色不均勻由細(xì)胞出芽形成菌絲，無(wú)隙，稱為假菌絲白假絲酵母菌厚壁孢子和假菌絲真菌皮屑試驗(yàn)方法：

1、取皮屑；

2、10％NaOH消化1min；

3、加蓋玻片，火焰上微微加熱；

4、直接低倍或高倍鏡檢。結(jié)果：觀察孢子和菌絲。培養(yǎng)基上支原體菌落衣原體包涵體Giemsa染色原體：紅色點(diǎn)狀細(xì)胞外始體：深藍(lán)色或暗紫色，細(xì)胞內(nèi)衣原體包涵體恙蟲(chóng)病立克次體病例五主訴：女性，30歲，乏力、厭食、惡心，伴尿色深黃5天。病史：患者2周前曾出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱，體溫37.5℃，無(wú)鼻塞、流涕、咳嗽、咳痰、皮疹等，無(wú)特殊治療而自愈。5天前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)乏力,體力明顯下降，胃納差，厭油，偶有惡心嘔吐，進(jìn)食后明顯，伴尿色逐漸加深至深黃。無(wú)尿路刺激征，無(wú)反酸、噯氣、腹痛、腹脹、發(fā)熱、畏寒等，無(wú)腹瀉粘液血便關(guān)節(jié)腫痛等。今日就診發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶異常，以"肝功異常原因待查"收入院?；颊呒韧w健，無(wú)肝炎和結(jié)核病史，疫苗接種史不詳，三個(gè)月前因外傷手術(shù)曾接受過(guò)輸血，否認(rèn)藥物過(guò)敏史，在她認(rèn)識(shí)的人中沒(méi)有類似癥狀者。查體：T37℃，BPl30／80mmHg，P80次／分，R12次／分；神志清，皮膚無(wú)黃疸、瘀斑或蜘蛛痣，鞏膜輕度黃染；肺肝濁音界位于右鎖骨中線第五肋間，肋下2cm處可觸及肝臟邊緣，質(zhì)軟，有壓痛及叩擊痛，腹平軟，無(wú)腹水征，腸鳴音正常；頸無(wú)抵抗，心肺無(wú)陽(yáng)性體征。病例五患者入院后即進(jìn)行腹部B超、胸部X線透視及實(shí)驗(yàn)室檢查（血常規(guī)、血生化檢查、糞便常規(guī)、尿常規(guī)、乙型肝炎血清學(xué)檢查），結(jié)果如下：腹部B超：肝臟輕度腫大，肝內(nèi)回聲稍增粗,脾臟未見(jiàn)明顯異常。胸片：心肺未見(jiàn)異常實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞壓積40％；WBC8.2×109/L,嗜中性粒細(xì)胞50%,淋巴細(xì)胞45%,單核細(xì)胞5%,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）600U/L,堿性磷酸酶（ALP）