中藥鑒別方法的現(xiàn)代探討

中藥鑒別方法的現(xiàn)代探討

中國(guó)的中藥資源豐富，應(yīng)用歷史悠久。由于我國(guó)地域遼闊,歷代“本草”對(duì)中藥形態(tài)特征的記述往往不十分詳盡和準(zhǔn)確,致使中藥的品種混亂現(xiàn)象相當(dāng)突出,同名異物,同物異名等始終未能澄清。這對(duì)中藥的生產(chǎn)、科研均有妨礙。此外,中藥市場(chǎng)以次充好、以假亂真現(xiàn)象也較普遍,且每種藥材存在成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、難以定性定量分析和有效成分不確定等缺點(diǎn),極大限制了中藥在臨床上的應(yīng)用。為了控制中藥質(zhì)量、保證臨床用藥的效果和患者的生命安全,中藥材的鑒別有著十分重要的意義。中藥鑒別方法可以分為經(jīng)典方法和現(xiàn)代方法,現(xiàn)分述如下。1經(jīng)典方法中藥經(jīng)典鑒別方法是在長(zhǎng)期大量的實(shí)踐基礎(chǔ)上,積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),總結(jié)和形成的一套行之簡(jiǎn)便的方法,是前人智慧的結(jié)晶。1.1性能類的鑒別它主要利用感覺(jué)器官的功能即眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等方法,觀察中藥的形狀、大小、色澤、質(zhì)地、斷面以及氣味等特征,有時(shí)輔以水試、火試等簡(jiǎn)單的物理和化學(xué)反應(yīng),直接作出判斷。卓丹如對(duì)冬蟲(chóng)夏草的鑒別進(jìn)行了較為詳盡描述。冬蟲(chóng)夏草與其常見(jiàn)的參雜品、混淆品、偽品等,形狀、氣、味、斷面等均有差異。1.2制劑本身的特征顯微鑒別是利用顯微鏡來(lái)觀察中藥粉末所具有的器官構(gòu)造、組織構(gòu)造碎片、細(xì)胞形狀以及內(nèi)含物的特征,以此來(lái)鑒別制劑的處方組成以及藥材真?zhèn)巍罘f對(duì)牛黃及其偽品進(jìn)行了顯微鑒別,天然牛黃可見(jiàn)不規(guī)則團(tuán)快,內(nèi)有黃棕色或紅棕色小顆粒集成的類方形晶體,遇水合氯醛色素迅速融解并顯明金黃色,久置變綠色。偽品均無(wú)天然牛黃的特征。1.3中藥經(jīng)典鑒別一般理化鑒別是針對(duì)中藥所含主要化學(xué)成分或有效成分,采用物理或化學(xué)方法進(jìn)行鑒別,包括熒光法、顯色法、沉淀法、升華法、結(jié)晶法等。一般用于性狀相似而又無(wú)明顯顯微鑒別特征且化學(xué)成分不同的藥材。馬洪梅對(duì)巴戟天及其偽品羊角藤進(jìn)行了理化鑒別,出現(xiàn)不同的熒光色澤。林苗等對(duì)山豆根及其混淆品朱砂根進(jìn)行了理化鑒別,二者顏色變化及沉淀行為均有不同。中藥經(jīng)典鑒別方法主觀性和經(jīng)驗(yàn)依賴性較強(qiáng),有一定實(shí)用價(jià)值,但是在指標(biāo)性成分鑒別方面具有局限性。近年來(lái),隨著色譜技術(shù)和光譜技術(shù)的發(fā)展,其在中藥鑒別方面的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛,借助先進(jìn)科學(xué)手段已成為中藥鑒別的研究熱點(diǎn)。2現(xiàn)代方法2.1識(shí)別標(biāo)記色譜鑒別是指使用薄層色譜、氣相色譜、液相色譜和連用技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行鑒別。2.1.1薄層色譜鑒別薄層色譜(TLC)鑒別可以在一塊層析板上容納多個(gè)樣品及出現(xiàn)多個(gè)信息,適合于天然藥物特別是中成藥組成成分復(fù)雜的情況,它具有分離和鑒定的雙重作用。該方法易于普及,其色譜直觀性強(qiáng)、快速、靈敏且分辨率高而被廣泛采用。徐列波等采用薄層色譜法成功鑒別了赤芍及其偽品地榆。結(jié)果顯示,地榆在赤芍苷對(duì)照樣品相應(yīng)的位置上不具斑點(diǎn)。薄層色譜分離機(jī)制非常復(fù)雜,目前所用的器材限制和操作中環(huán)境干擾因素影響較大,重現(xiàn)性較差,為了提高薄層色譜鑒別分析的質(zhì)量,需注意供試液的制備、點(diǎn)樣、相對(duì)濕度、溫度、溶劑蒸汽等因素的影響。2.1.2gc色譜分析氣相色譜法(GC)可以分析氣體及有一定揮發(fā)性的液體和固體樣品。對(duì)于后二者,原則上要求在操作條件下只要能產(chǎn)生不小于0.2~10mm汞柱的蒸氣壓力,都可進(jìn)行分析。郭曉玲等采用氣相色譜法,對(duì)高要、石牌、吳川、遂溪、雷州及海南萬(wàn)年產(chǎn)廣藿香揮發(fā)油進(jìn)行GC圖譜的比較分析,建立了廣藿香揮發(fā)油的特征指紋圖譜,可用于廣藿香的品質(zhì)控制及產(chǎn)地鑒別。沈振鐸等采用氣相色譜法對(duì)26批五味子藥材進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)南、北五味子GC指紋圖譜差異可以很容易地將它們相互區(qū)別開(kāi)來(lái)。2.1.3藥代動(dòng)力學(xué)研究高效液相色譜法(HPLC)作為一項(xiàng)高效、快速的分離分析技術(shù),在中藥領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用,幾乎所有的中藥有效成分均可進(jìn)行HPLC分離分析,是中藥指紋圖譜研究的常用手段。運(yùn)用梯度洗脫和二極管陣列監(jiān)測(cè)器,還可以得到分辨率高的三維色譜圖,因而可以較全面地檢測(cè)中藥材中多種成分分布的全貌。李正國(guó)等使用高效液相色譜法對(duì)半夏水提物進(jìn)行了檢測(cè),確定了9個(gè)峰作為鑒別半夏藥材與半夏替用品和偽品的群體特征峰,為半夏藥材的鑒定提供了重要參考。陳閩軍等用高效液相色譜法獲得川芎藥材的色譜圖,從中提取15個(gè)色譜峰可用作指紋特征,結(jié)果表明不同產(chǎn)地川芎的指紋圖譜存在明顯差異,可用于川芎藥材的產(chǎn)地鑒別。2.2不同的光譜用于鑒別鑒別光譜鑒別的基本原理是利用中藥光譜學(xué)行為的不同,記錄其光譜用于鑒別。其常用方法有:紫外檢測(cè)法、紅外光譜法、近紅外光譜法、質(zhì)譜法、X-射線衍射法等。2.2.1法測(cè)荷葉堿含量的測(cè)定紫外鑒別是將中藥進(jìn)行提取,對(duì)其提取液采用紫外測(cè)定法對(duì)中藥進(jìn)行評(píng)價(jià)。趙駿等利用紫外法測(cè)定了不同生長(zhǎng)期及不同產(chǎn)地荷葉中荷葉堿的含量,為荷葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。但是此方法局限較大,這是由于中藥成分較多,若分子中發(fā)色基團(tuán)相同,而其它部分的結(jié)構(gòu)略有不同,則它們的紫外吸收光譜常常十分相似。因此,紫外光譜只適用于小范圍內(nèi)的鑒別。2.2.2陳皮道地藥材鑒別紅外光譜法是將中藥粉末或其不同極性溶劑提取物采用壓片法或涂片法在紅外光譜區(qū)進(jìn)行測(cè)定得到紅外光譜,根據(jù)圖譜差異進(jìn)行鑒別。周欣等采用采用傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)分析鑒別了7個(gè)不同產(chǎn)地的陳皮揮發(fā)油,其指紋特征可作為陳皮道地藥材的一種簡(jiǎn)單、快速的鑒別依據(jù)。張韜等建立了勝紅薊不同提取物的紅外光譜鑒別法。結(jié)合勝紅薊中含揮發(fā)油、黃酮及各種苷類的紅外特征將光譜圖分為3個(gè)區(qū)段,試驗(yàn)結(jié)果表明用極性不同溶劑提取的藥材其提取物與藥材殘?jiān)募t外光譜在這3個(gè)區(qū)段有顯著的差異。2.2.3近紅外技術(shù)的特點(diǎn)近紅外光指可見(jiàn)光譜區(qū)到中紅外光譜區(qū)之間的電磁波,譜區(qū)范圍為780nm~2526nm(12820cm-1-3959cm-1),其光譜信息來(lái)源于分子內(nèi)部振動(dòng)的倍頻與合頻吸收,并且主要反映分子中C-H,N-H,O-H基團(tuán)的倍頻和合頻振動(dòng)吸收。近紅外技術(shù)最大特點(diǎn)是對(duì)樣品無(wú)破壞性,不需要預(yù)處理,不消耗化學(xué)試劑;分析迅速,一次分析僅需幾十秒到幾分鐘;和光導(dǎo)纖維技術(shù)相結(jié)合,儀器測(cè)量信號(hào)又可以遠(yuǎn)距離傳輸和分析;可以直接對(duì)顆粒狀、固體狀、糊狀,乳狀等不透明的樣品進(jìn)行分析。近紅外光譜法常與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合,用于藥材鑒別。丁念亞等應(yīng)用近紅外漫反射光譜分析技術(shù)對(duì)幾種常見(jiàn)中藥建立了一種簡(jiǎn)單、快速、有效的分類和真?zhèn)舞b別方法。2.2.4與色譜法聯(lián)用技術(shù)質(zhì)譜法是在真空系統(tǒng)中將樣品分子離解成帶電的離子,并通過(guò)對(duì)生成離子的質(zhì)量和強(qiáng)度測(cè)定,而進(jìn)行樣品成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)為靈敏度高、分析速度快、所需樣品用量少,加之該法可提供多維結(jié)構(gòu)信息并可與色譜法聯(lián)用,故在中藥鑒別中得到了廣泛應(yīng)用。聯(lián)用技術(shù)集色譜的高效分離與質(zhì)譜的強(qiáng)鑒定力于一體,不僅有足夠的靈敏度、選擇性,同時(shí)還能給出一定的結(jié)構(gòu)信息,分析快速且方便,具有其他分析方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)。常用的聯(lián)用技術(shù)有高效液相-質(zhì)譜法(HPLC-MS)、氣相-質(zhì)譜法(GC-MS)。此外,還有HPLC-DAD-ELSD、CE-MS等聯(lián)用方法。趙陸華等采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)13個(gè)產(chǎn)地烏骨藤指紋圖譜的相似度研究,評(píng)價(jià)了不同產(chǎn)地烏骨藤的質(zhì)量。張語(yǔ)遲等通過(guò)HPLC-ESI-MS指紋圖譜對(duì)中藥西洋參與北沙參進(jìn)行了鑒別,方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,具有實(shí)用價(jià)值。2.2.5中藥鑒定方法X射線衍射法是利用各藥材的相組成、成分各不相同,被X射線照射而產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象,產(chǎn)生特有的衍射圖譜的方法對(duì)中藥進(jìn)行鑒定的方法。此方法獲得的圖譜信息量大、指紋性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠且可以記錄,有的還可以根據(jù)國(guó)際粉末衍射聯(lián)合委員會(huì)出版的一套粉末衍射數(shù)據(jù)卡片定性分析,因此可作為物質(zhì)定性的可靠依據(jù)。張漢明等對(duì)200多種中藥和成藥進(jìn)行分析,得到較滿意的結(jié)果。但是衍射法的應(yīng)用對(duì)于成分和晶型均為相同或極少差異的藥材鑒別仍然比較困難,故有其專用范圍。2.2.6維相關(guān)譜圖進(jìn)行識(shí)別廣義二維相關(guān)光譜法是指對(duì)一般光譜進(jìn)行相關(guān)性分析,得到光譜的二維尺度信息,包括包括同步相關(guān)光譜和異步相關(guān)光譜。對(duì)于一個(gè)待分析體系,對(duì)其施加一個(gè)外部微擾,則體系會(huì)產(chǎn)生一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化,其光譜行為就會(huì)發(fā)生變化,運(yùn)用相關(guān)分析對(duì)其譜圖進(jìn)行處理,可得到二維相關(guān)光譜。廣義二維相關(guān)光譜對(duì)重疊信號(hào)有很強(qiáng)的分辨能力,在特征分析、結(jié)構(gòu)分析、相互作用、化學(xué)反應(yīng)等研究領(lǐng)域重疊信號(hào)分析方面有很廣泛的用途,為中藥鑒定提供了一種快速、簡(jiǎn)便的可視化手段。劉浩等應(yīng)用二維相關(guān)近紅外光譜分析方法,借助于計(jì)算機(jī),將近紅外光譜從一維拓展到二維,研究了變溫過(guò)程中香加皮的近紅外指紋圖譜,并與五加皮進(jìn)行了比較,代替了繁瑣的色譜指紋圖譜等傳統(tǒng)分析手段,實(shí)現(xiàn)了快速無(wú)損鑒別。JunLu等等將廣義二維相關(guān)光譜應(yīng)用于4個(gè)產(chǎn)地枸杞藥材的鑒別,說(shuō)明其能區(qū)分重疊嚴(yán)重的近紅外光譜,發(fā)現(xiàn)中藥的近紅外特征,為枸杞提供一種便捷直觀的鑒別方法。2.3化學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)處理化學(xué)計(jì)量學(xué)方法是一門化學(xué)分支學(xué)科,它應(yīng)用它應(yīng)用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的工具和手段及最新的研究成果來(lái)分析、處理化學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)以最大限度的獲取化學(xué)及其相關(guān)信息。從上世紀(jì)80年代開(kāi)始,化學(xué)計(jì)量學(xué)已逐步引入到中藥鑒別領(lǐng)域。然而其并不單獨(dú)使用,往往需要結(jié)合其他儀器分析方法(如色譜、光譜等)用于中藥鑒別。就具體方法而言主要包括聚類分析、模式識(shí)別及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)。2.3.1聚類分析聚類分析所謂聚類分析,就是將一批樣品或變量,按照它們?cè)谛再|(zhì)上親疏遠(yuǎn)近的程度進(jìn)行分類。聚類分析常分為系統(tǒng)聚類分析、動(dòng)態(tài)聚類分析、模糊聚類分析、主成分分析。劉木清等對(duì)8個(gè)中藥樣品的近紅外光譜建立了定性數(shù)學(xué)模型,然后進(jìn)行聚類分析,并選擇不同的聚類方法進(jìn)行優(yōu)化,產(chǎn)生的聚類樹(shù)中,8個(gè)樣品的聚類性質(zhì)與其實(shí)際特性相符良好。2.3.2不同產(chǎn)地的藥材鑒別模式識(shí)別就是利用計(jì)算機(jī)對(duì)某些物理對(duì)象進(jìn)行分類,在錯(cuò)誤概率最小的條件下,使識(shí)別的結(jié)果盡量與客觀實(shí)物相符。模式識(shí)別方法主要包括最小距離判決法、貝葉斯判別法、PRIMA法、SIMCA法、粗糙集法等。劉沭華等取得來(lái)自不同產(chǎn)地的中藥材紅外圖譜,采用近鄰法和多類支持向量機(jī)方法對(duì)采自4個(gè)不同產(chǎn)地的269個(gè)白芷樣本和6個(gè)不同產(chǎn)地的380個(gè)丹參樣本進(jìn)行了產(chǎn)地鑒別,得到的交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)99%。聶磊等以不同產(chǎn)地黃芪藥材高效液相色譜指紋圖譜為研究對(duì)象,通過(guò)粗糙集方法對(duì)屬性特征進(jìn)行約簡(jiǎn),選取與產(chǎn)地鑒別相關(guān)的特征峰,并用聚類分析對(duì)藥材產(chǎn)地進(jìn)行鑒別,結(jié)果表明基于粗糙集方法選取相關(guān)特征色譜峰可以作為鑒別依據(jù)用于黃芪藥材的產(chǎn)地鑒別。2.3.3小波變換多分辨率分析人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是用工程技術(shù)手段模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)特征和功能特征的一類人工系統(tǒng)。它用非線性處理單元來(lái)模擬生物神經(jīng)原,用處理單元之間的可變聯(lián)接強(qiáng)度來(lái)模擬突觸行為,構(gòu)成一個(gè)大規(guī)模并行的非線性系統(tǒng)。程存歸等運(yùn)用基于連續(xù)小波變換多分辨率分析法對(duì)吸收較為相似的菟絲子及金燈藤子的FTIR進(jìn)行特征提取,得到有用的相關(guān)信息,選擇第7,10,13分辨率下的特征值作為分析的基礎(chǔ),通過(guò)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練,再用訓(xùn)練出來(lái)的網(wǎng)絡(luò)對(duì)不同產(chǎn)地的植物中藥材菟絲子和同科屬的金燈藤子所得FTIR小波提取的特征向量進(jìn)行分類。此方法在同科屬植物中藥材菟絲子及金燈藤子的鑒別上具有較好的可行性。2.4其他身份驗(yàn)證2.4.1化學(xué)電池的測(cè)量電化學(xué)分析法是一類基于電池內(nèi)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)而建立的分析方法。測(cè)定時(shí)一般是根據(jù)待測(cè)物溶液的電化學(xué)性質(zhì),選擇適當(dāng)?shù)碾姌O組成化學(xué)電池,通過(guò)測(cè)量電信號(hào)強(qiáng)度或其變化對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行定性、定量分析。張?zhí)┿懙确治隽诉m用于中藥成分群集電化學(xué)表征的熱力學(xué)體系和動(dòng)力學(xué)模型,討論了遠(yuǎn)離平衡態(tài)熱力學(xué)封閉體系和無(wú)耗散物補(bǔ)充的敞開(kāi)體系中阻尼振蕩反應(yīng)對(duì)中藥化學(xué)成分分析與群集表征的重要意義,成功提出了鑒別與評(píng)價(jià)中藥的電化學(xué)指紋圖的檢測(cè)方法和條件。2.4.2各成分移動(dòng)方向和速度的影響電泳法鑒別中藥的原理是:利用中藥中含有蛋白質(zhì)等帶電荷的成分,在同一電場(chǎng)作用下,由于各組分所帶的電荷性質(zhì)、電荷數(shù)目以及分子質(zhì)量不同,而泳動(dòng)方向和速度不同,在一定時(shí)間內(nèi),各成分移動(dòng)距離不同,結(jié)合譜帶條數(shù)和染色不同而達(dá)到分離鑒別的目的。其中毛細(xì)管電泳法又叫高效毛細(xì)管電泳法,指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,以毛細(xì)管為分離通道,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和(或)分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相分離技術(shù),是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。葉會(huì)洲等使用蛋白電泳法得到苦杏仁和桃仁的不同電泳譜。王德先用毛細(xì)管電泳技術(shù)較容易的鑒別了天麻及其4種偽品。2.4.3白、免疫鑒別免疫分析法是指以特異抗原-抗體反應(yīng)微基礎(chǔ)的分析方法。不同的動(dòng)植物藥材含有不同的特異蛋白,免疫鑒別即利用該蛋白制備的特異抗體與待檢品中的特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)來(lái)鑒別藥材的真?zhèn)?。?guó)內(nèi)學(xué)者采用免疫電泳法及瓊脂免疫擴(kuò)散法準(zhǔn)確鑒定了虎、豹等多種動(dòng)物的骨骼,還能將豹骨進(jìn)一步鑒定為雪豹、石豹或金錢豹,說(shuō)明免疫鑒別方法是一種特異性很強(qiáng)的鑒別法。2.4.4中藥的生物學(xué)研究中藥鑒別最具有決定意義的應(yīng)該是DNA鑒定。DNA是物種的遺傳物質(zhì),物種的差異規(guī)根結(jié)底是由于它們DNA之間的核酸序列不同。中藥的DNA鑒定,通過(guò)對(duì)中藥品種基因組的直接分析,不僅有助于正本清源,而且對(duì)于建立我國(guó)名貴中藥材的基因庫(kù),了解這些品種的遺傳變遷狀況及代用品間血緣關(guān)系都有重大意義。目前,用于中藥鑒別的分子生物學(xué)方法主要有:隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、DNA直接測(cè)序法、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)、多聚酶鏈反應(yīng)測(cè)序技術(shù)、生物芯片技術(shù)、DNA指紋技術(shù)等。徐紅等從RAPD引物中篩選出4條具有鑒別意義的多態(tài)性引物,在3種秦艽中共得到39個(gè)DNA條帶,其中共有條帶2條,多態(tài)條帶37個(gè)。據(jù)此獲得了能有效區(qū)別3種秦艽的多態(tài)性RAPD指紋譜。2.4.5主要技術(shù)及方法主要是染色體分類技術(shù)。某個(gè)特定種群的生物體細(xì)胞中染色體的形態(tài)、組型、帶型是穩(wěn)定不變的,代表著該種群的基本遺傳特征。根據(jù)該特征,可以確定藥材的種屬。由于染色體形態(tài)只能在細(xì)胞分