藤梨根對人結(jié)腸癌rko細(xì)胞懸浮生長及失巢凋亡的影響

藤梨根對人結(jié)腸癌rko細(xì)胞懸浮生長及失巢凋亡的影響

抗癲癇藥物的使用已經(jīng)成為中醫(yī)臨床上的一種重要治療方法，對研究闡明了抗癲癇藥物的作用和特點(diǎn)具有重要意義。藤梨根是中醫(yī)腫瘤臨床常用中藥,其主要成分包括多糖、熊果酸、齊墩果酸等,藤梨根具有抗氧化、抗癌以及抗血管生成等藥理作用;已證實(shí)藤梨根在大腸癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤中具有抗癌作用,但藤梨根對懸浮腫瘤細(xì)胞的作用缺乏研究。本研究在大腸癌細(xì)胞模型中觀察了藤梨根對懸浮生長大腸癌細(xì)胞的作用,以期為臨床用藥及進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。1材料表面1.1藥物、藥物等的混溶藥藤梨根由龍華醫(yī)院中藥房提供,批號2012040506,產(chǎn)地江蘇,上海華浦中藥飲片有限公司;藤梨根由龍華醫(yī)院藥劑科許麗雯副主任藥師鑒定,為獼猴桃科植物中華獼猴桃ActinidiachinensisPlanch的干燥根。1.2y和polush-hema人結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO(購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫),CytoSelectTM24-WellAnoikisAssay(批號11665,美國CellBiolabs公司),CellCountingKit-8(CCK-8,批號DL765,[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司],poly-HEMA(批號SLBB4988V,美國SigmaAldrich公司);Caspase-3活性檢測試劑盒(批號313323,美國Promega公司),活性氧檢測試劑盒(批號0402261212,江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。1.3酶標(biāo)儀和檢測方法NAPCO-5410型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Napco公司),ThermoVarioskan型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司),Olympus1×70型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。2細(xì)胞存活率及caspase-3活性檢測2.1中藥制備參考文獻(xiàn)方法制備中藥,藤梨根300g加8倍量水,浸泡1h,煎煮2次,每次30min,紗布粗濾去渣,合并濾液、濃縮,18000r·min-1離心30min,取上清加入等體積乙醇,4℃過夜;18000r·min-1離心30min,取上清液冰凍干燥,稱重,無血清RPMI1640溶解,調(diào)濃度至400g·L-1,依次0.45,0.22μm濾器過濾除菌,1mL分裝,4℃保存?zhèn)溆谩?.2細(xì)胞懸浮生長檢測1×104個(gè)對數(shù)生長期RKO細(xì)胞接種于poly-HEMA包被96孔板,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果接種后第2天加入終質(zhì)量濃度200～800mg·L-1藤梨根或等體積RPMI1640,每組3個(gè)復(fù)孔;藥物作用24h后加入10μLCCK-8,37℃反應(yīng)2h,酶標(biāo)儀450nm波長檢測各孔吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)組/A對照組×100%2.3失巢凋亡檢測1×105個(gè)對數(shù)生長期RKO細(xì)胞接種于poly-HEMA包被24孔板,接種后第2天加入不同質(zhì)量濃度中藥或等體積RPMI1640,每組3個(gè)復(fù)孔;藥物作用24h后加入1μLEthD-1,37℃反應(yīng)1h,熒光酶標(biāo)儀檢測A(激發(fā)波長525nm,發(fā)射波長590nm),熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。2.4caspase-3活性檢測1×106個(gè)對數(shù)生長期RKO細(xì)胞接種于poly-HEMA包被直徑6cm培養(yǎng)皿,接種后第2天加入不同質(zhì)量濃度中藥或等體積RPMI1640,每組3個(gè)樣本;藥物作用24h后收集細(xì)胞,按操作說明書采用酶底物法檢測caspase-3活性。2.5活性氧檢測5×105對數(shù)生長期RKO細(xì)胞接種細(xì)胞于poly-HEMA包被6孔板,接種后第2天加入不同濃度中藥或等體積RPMI1640,空白組不作處理,每組3個(gè)樣本;藥物作用24h后收獲細(xì)胞,加入含DCFH-DA探針(10μmol·L-1)的無血清RPMI1640,37℃孵育20min后,酶標(biāo)儀測各孔A(激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長525nm)。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用單向方差分析,組間兩兩比較用LSD法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1rk細(xì)胞的懸浮生長影響200～800mg·L-1藤梨根可顯著抑制RKO細(xì)胞懸浮生長,與對照組比較差異顯著(P<0.01)。見圖1。3.2藤梨根對rko細(xì)胞凋亡的影響200～800mg·L-1藤梨根作用后RKO細(xì)胞可吸收EthD-1呈現(xiàn)紅色熒光,部分細(xì)胞可見核碎裂,藤梨根不同劑量組熒光吸光度(A)與對照組比較差異顯著(P<0.01),提示藤梨根可促RKO細(xì)胞失巢凋亡。見圖2。3.3rk細(xì)胞cappare-3的活性200～800mg·L-1藤梨根可以顯著增強(qiáng)懸浮生長RKO細(xì)胞caspase-3活性(P<0.01)。見圖3。3.4藤梨根對ros活性的影響200～800mg·L-1藤梨根可以顯著升高懸浮生長RKO細(xì)胞內(nèi)ROS水平,藤梨根不同劑量組熒光A與對照組比較差異顯著(P<0.01)。見圖4。4藤梨根對rko細(xì)胞凋亡和caspase-3活性的影響上皮細(xì)胞需要胞外基質(zhì)上提供存活信號,脫離胞外基質(zhì)黏附細(xì)胞將發(fā)生凋亡,即失巢凋亡(anoikis),anoikis是1個(gè)希臘詞匯,原意無家可歸(homelessness);失巢凋亡現(xiàn)象由Frish等于1994年首次發(fā)現(xiàn)。上皮來源腫瘤細(xì)胞在血液或淋巴循環(huán)中的存活與失巢凋亡耐受相關(guān)。腫瘤細(xì)胞由于基因表達(dá)或活性異常而獲得一定程度的失巢凋亡耐受,使得部分腫瘤細(xì)胞可以在血液或淋巴循環(huán)中存活,最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移,失巢凋亡已成為腫瘤治療新的靶標(biāo)。poly-HEMA是一種無毒陰離子聚合物,具有均勻的非離子特性,鋪在培養(yǎng)皿底部,可阻止細(xì)胞貼壁,使細(xì)胞只能懸浮生長,本研究結(jié)果顯示藤梨根可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞在poly-HEMA包被板中的生長,提示藤梨根對懸浮生長結(jié)腸癌細(xì)胞具有抗癌作用。EthD-1(Ethidiumhomodimer)是一種核酸熒光染料,EthD-1可以進(jìn)入破損細(xì)胞結(jié)合核酸,呈現(xiàn)紅色熒光信號,但不能滲透活細(xì)胞,因此常用作死亡細(xì)胞的熒光染色指示劑;CytoSelectTM24-WellAnoikisAssay試劑盒以EthD-1為標(biāo)記,結(jié)合細(xì)胞在poly-HEMA包被板懸浮生長檢測細(xì)胞失巢凋亡。本研究EthD-1染色顯示藤梨根作用后部分RKO細(xì)胞吸收EthD-1呈現(xiàn)紅色熒光,部分細(xì)胞還可見核碎裂,提示藤梨根可以促使RKO細(xì)胞失巢凋亡。失巢凋亡是一種特殊形式的凋亡,失巢凋亡也是由caspase級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的。上皮細(xì)胞與胞外基質(zhì)黏附后經(jīng)整合素介導(dǎo),形成Focaladhesionplaque,促使黏著斑激酶(FAK)構(gòu)象變化而活化。FAK下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與MAPK,PI3K-AKT等信號通路有關(guān)。細(xì)胞脫離基質(zhì)黏附后FAK到MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制,致使細(xì)胞凋亡分子調(diào)控失常,活化caspases。與細(xì)胞凋亡一樣,失巢凋亡也可以通過內(nèi)源或外源通路,分別活化caspase-9或caspase-8,進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白酶caspase-3,引發(fā)失巢凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)藤梨根可以活化懸浮狀態(tài)RKO細(xì)胞caspase-3,提示藤梨根對RKO細(xì)胞失巢凋亡作用與caspase-3活性相關(guān)。ROS是細(xì)胞在有氧代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇,細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化可以引起腫瘤細(xì)胞一系列與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)信號通路的變化,提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平可活化細(xì)胞內(nèi)caspases活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。ROS是中藥活化caspase信號通路,介導(dǎo)抗癌作用的重要機(jī)制,已發(fā)現(xiàn)大黃素、姜黃素等中藥組分可以通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平促