粉塵螨類重組變應(yīng)原對(duì)過敏性哮喘小鼠免疫治療效果的研究

粉塵螨類重組變應(yīng)原對(duì)過敏性哮喘小鼠免疫治療效果的研究

這種過敏反應(yīng)是世界上的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率為10%-30%。過敏性哮喘屬于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),是臨床上的常見病和多發(fā)病,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。塵螨是最常見的吸入性變應(yīng)原,其中與人類變態(tài)反應(yīng)性疾病關(guān)系最密切的主要有粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋塵螨(D.pteronyssinus),其分泌物、排泄物和尸體的降解產(chǎn)物均可引起人類變態(tài)反應(yīng)性疾病?，F(xiàn)已報(bào)道的塵螨變應(yīng)原逾30種,其中最重要且研究最多的是Ⅰ類和Ⅱ類變應(yīng)原,而對(duì)粉塵螨Ⅲ類變應(yīng)原(Derf3)的研究尚淺。rDerf3與過敏性哮喘患者血清IgE抗體的特異性結(jié)合率為16%~100%,且具有胰蛋白酶活性。本課題組前期以rDerf3為致敏原成功誘導(dǎo)了小鼠產(chǎn)生過敏性哮喘,本研究擬以rDerf3為疫苗,治療以該重組變應(yīng)原致敏的過敏性哮喘小鼠模型,通過觀察小鼠肺組織病理切片、支氣管肺泡灌洗液(BALF)和脾細(xì)胞上清中白細(xì)胞介素-5(IL-5)和γ干擾素(IFN-γ)水平、血清中特異性IgE抗體和IgG2a抗體水平,以及BALF中白細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo),評(píng)價(jià)其治療效果,從而為后期進(jìn)一步制備廣譜、高效的粉塵螨抗原特異性疫苗提供參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c雌性小鼠40只(SPF級(jí)),6~8周齡,體重18~22g,購于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。1.1.2ga抗體檢測原核表達(dá)并純化的rDerf3由本實(shí)驗(yàn)室保存;小鼠變應(yīng)原特異性IgE、IgG2a抗體,IL-5和IFN-γ等ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司;雞卵清蛋白(OVA)GradeⅤ購自美國Sigma公司;劉氏染液(Liu’sstain)購自珠海貝索生物技術(shù)公司;臺(tái)盼藍(lán)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.2方法1.2.1免疫治療組pbs40只BALB/c小鼠隨機(jī)均分為4組,哮喘(Asthma)組、免疫治療(SIT)組、卵清蛋白(OVA)組和PBS組,分別在第0、7和14天哮喘組和免疫治療組小鼠經(jīng)腹腔注射100μl致敏液(含rDerf310μg,Al(OH)32mg,溶于PBS,pH7.2),卵清蛋白組每鼠經(jīng)腹腔注射100μl致敏液(含OVA10μg,Al(OH)32mg,溶于PBS,pH7.2),PBS組則以PBS代替致敏液。第21天起,哮喘組和免疫治療組小鼠進(jìn)行滴鼻激發(fā)試驗(yàn)(將10μg/mlrDerf3蛋白溶液用PBS稀釋,每天滴鼻10min,連續(xù)滴鼻7d),免疫治療組小鼠在第25~27天滴鼻激發(fā)前30min,用100μgrDerf3純化蛋白皮下注射進(jìn)行特異性免疫治療。PBS組和OVA組分別用PBS和OVA進(jìn)行滴鼻激發(fā)和皮下注射,最后一次滴鼻激發(fā)24h后進(jìn)行取材檢測。1.2.2elisa檢測細(xì)胞活性最后1次滴鼻激發(fā)后24h內(nèi),各組小鼠均給予腹腔注射10%水合氯醛0.2~0.3ml進(jìn)行麻醉,仰臥固定,行氣管插管,緩慢注入無菌預(yù)冷的PBS1ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,按0.4ml、0.3ml、0.3ml灌洗3次后,回收BALF,回收率>90%。4℃1000×g離心10min,收集細(xì)胞沉淀,用1mlPBS進(jìn)行重懸,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106/ml;另取細(xì)胞懸液涂片,進(jìn)行劉氏染色后,光鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞數(shù)。ELISA檢測上清中變應(yīng)原特異性細(xì)胞因子IL-5和IFN-γ的含量,在樣品孔中依次加入待測樣品血清(40μl/孔)、抗-IL-2/IFN-γ抗體(10μl/孔)、鏈霉親和素-HRP(50μl/孔),37℃孵育1h。用洗滌液洗板5次,避光顯色10min,最后加入終止液終止反應(yīng),測吸光度(A450)值。1.2.3免疫組化檢測取各組小鼠眼球血,ELISA板樣品孔中依次加入待測樣品血清(40μl/孔)、抗-IgE/IgG2a抗體(10μl/孔)、鏈霉親和素-HRP(50μl/孔),37℃孵育1h。用洗滌液洗板5次,避光顯色10min,最后加入終止液終止反應(yīng),測A450值。1.2.4活細(xì)胞制備脾細(xì)胞取血后將小鼠脫臼處死,75%酒精中浸泡30min后,無菌條件下分離小鼠脾臟,用300目細(xì)胞篩過濾,PBS平衡液重懸脾細(xì)胞,紅細(xì)胞裂解液(EDTA-NH4Cl)裂解,靜置10min,4℃1000×g離心10min,棄上清,沉淀用RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素)重懸,制成脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度至5×106/ml。然后用臺(tái)盼藍(lán)染色,觀察活細(xì)胞>98%者即可用于實(shí)驗(yàn)。取脾細(xì)胞懸液1ml加入96孔板中,PBS組、卵清蛋白組、哮喘組和免疫治療組分別加入相應(yīng)抗原溶液至終濃度為25μg/ml,37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h,取上清,ELISA檢測變應(yīng)原特異性細(xì)胞因子IL-5和IFN-γ的含量。1.2.5肺組織疾病的病理切開術(shù)和he染色取各組小鼠肺組織,10%甲醛溶液固定過夜,石蠟包埋,常規(guī)切片并進(jìn)行HE染色,鏡下觀察肺組織炎癥細(xì)胞浸潤情況。1.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,檢驗(yàn)水平為α=0.05。2結(jié)果2.1炎癥細(xì)胞感染肺組織切片經(jīng)HE染色后,哮喘組和卵清蛋白組小鼠支氣管、血管黏膜下和周圍肺部組織有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞為主,大量炎癥細(xì)胞向血管和小支氣管遷移,肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)也可見炎癥細(xì)胞浸潤;支氣管管壁增厚,血管壁明顯水腫;支氣管上皮細(xì)胞部分?jǐn)嗔鸭懊撀?偶見纖維化增生,部分可見黏液栓(圖1A、B)。而免疫治療組小鼠炎癥反應(yīng)明顯減輕,氣道、血管和肺泡結(jié)構(gòu)與PBS組相近,基本無炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象(圖1C、D)。2.2卵清蛋白和哮喘組的白領(lǐng)總數(shù)見表1對(duì)BALF中白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),卵清蛋白組、哮喘組和免疫治療組分別為(22.11±3.70)×108/ml、(22.75±3.24)×108/ml和(7.03±1.38)×108/ml,與PBS組相比,卵清蛋白組和哮喘組的白細(xì)胞總數(shù)顯著增多(P<0.01);而免疫治療組與PBS組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但明顯低于卵清蛋白組和哮喘組(P<0.01)。BALF中嗜酸粒細(xì)胞的變化趨勢與白細(xì)胞類似(圖2)。2.3baf中ifn-的變化ELISA檢測結(jié)果顯示,IL-5水平卵清蛋白組、哮喘組和免疫治療組分別為(182.04±13.94)pg/ml、(195.33±15.33)pg/ml和(108.20±11.02)pg/ml,與PBS組相比,卵清蛋白組和哮喘組明顯升高(P<0.01);而免疫治療組與PBS組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但低于卵清蛋白組和哮喘組(P<0.01)。BALF中IFN-γ的變化趨勢則與IL-5相反,卵清蛋白組、哮喘組和免疫治療組IL-5的水平分別為(62.97±14.08)pg/ml、(54.01±17.99)pg/ml和(107.98±12.64)pg/ml,與PBS組相比,卵清蛋白組和哮喘組明顯降低(P<0.01);而免疫治療組與PBS組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但顯著高于卵清蛋白組和哮喘組(P<0.01)(圖3)。2.4兩組il-5水平比較ELISA檢測結(jié)果顯示,卵清蛋白組和哮喘組中IL-5的水平分別為(208.26±10.63)pg/ml和(179.54±13.65)pg/ml,明顯高于PBS組(P<0.01);而免疫治療組的IL-5水平[(98.34±13.06)pg/ml]顯著低于與卵清蛋白組和哮喘組(P<0.01),但與PBS組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。卵清蛋白組和哮喘組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平分別為(73.82±17.61)pg/ml和(78.84±14.12)pg/ml,明顯低于PBS組(P<0.01);而免疫治療組中的IFN-γ水平[(105.51±11.62)pg/ml]明顯高于卵清蛋白組和哮喘組(P<0.01),但與PBS組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。2.5免疫治療對(duì)ige抗體水平的影響ELISA檢測結(jié)果顯示,卵清蛋白組和哮喘組血清中的特異性IgE抗體水平分別為(26.87±4.30)IU/ml和(35.25±8.84)IU/ml,明顯高于PBS組(P<0.01);而免疫治療組中IgE抗體水平[(9.12±3.78)IU/ml]明顯低于卵清蛋白組和哮喘組(P<0.01),但與PBS組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5A)。卵清蛋白組和哮喘組血清中特異性IgG2a抗體水平分別為(24.82±6.94)μg/ml和(22.75±2.99)μg/ml,明顯高于PBS組(P<0.01);而免疫治療組IgG2a抗體水平[(38.52±6.33)μg/ml]顯著升高(P<0.01),與PBS組、卵清蛋白組和哮喘組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖5B)。3th1和th2變化對(duì)臨床療效的影響過敏性哮喘是一種以肺部嗜酸粒細(xì)胞浸潤、黏液過度分泌和氣道高反應(yīng)性為特征的慢性氣道炎癥疾病,而粉塵螨變應(yīng)原是最重要的誘發(fā)因素之一,約80%的哮喘患者對(duì)粉塵螨過敏。其中粉塵螨Ⅲ類變應(yīng)原(Derf3)具有較強(qiáng)的變應(yīng)原性,可激活人體激肽釋放酶-激肽系統(tǒng),引起外周血特異性IgE抗體水平升高。本課題組前期研究證實(shí),用粉塵螨Ⅲ類重組變應(yīng)原(rDerf3)為致敏源可成功誘發(fā)小鼠產(chǎn)生過敏性哮喘,說明其具有較強(qiáng)的變應(yīng)原性。目前認(rèn)為,哮喘的發(fā)病機(jī)制主要是由于Th0偏向Th2分化導(dǎo)致Th1/Th2失衡所致。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子,IFN-γ在小鼠B淋巴細(xì)胞合成IgG2a抗體過程中起著關(guān)鍵作用,同時(shí)IFN-γ能有效抑制IL-4誘導(dǎo)的IgE抗體產(chǎn)生;而Th2細(xì)胞則主要分泌IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子。特異性免疫治療(SIT)是目前惟一可改變變應(yīng)性疾病進(jìn)程的病因療法。成功的特異性免疫治療不僅能有效降低Th2型細(xì)胞因子(如IL-5)的水平,也能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子的分泌水平增高,從而能有效地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和降低變態(tài)反應(yīng)。特異性免疫治療的臨床療效證實(shí),其不僅可降低變