過(guò)敏性過(guò)氧化應(yīng)激劑對(duì)哮喘小鼠細(xì)胞il

過(guò)敏性過(guò)氧化應(yīng)激劑對(duì)哮喘小鼠細(xì)胞il

專(zhuān)業(yè)免疫治療（sit）被認(rèn)為是一種獨(dú)特的病因治療哮喘的療法，但其具體機(jī)制尚不清楚。既往的研究多集中在該方法對(duì)IgE的影響上。但I(xiàn)gE主要介導(dǎo)哮喘的速發(fā)相反應(yīng),對(duì)氣道的慢性變應(yīng)性炎癥不起重要作用。研究證明,哮喘患者具有明顯的Th1/Th2細(xì)胞因子偏移,即Th2細(xì)胞因子表達(dá)明顯增加。近年發(fā)現(xiàn),SIT可下調(diào)CD4+T細(xì)胞的免疫功能,糾正Th1/Th2細(xì)胞的偏移。但其作用機(jī)制仍不完全清楚。文獻(xiàn)報(bào)道,大劑量過(guò)敏原誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制可能涉及到抗原特異性的Th2細(xì)胞克隆凋亡或不反應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)利用不同濃度過(guò)敏原在體外條件下處理哮喘小鼠T細(xì)胞,觀察各濃度處理組IL-5產(chǎn)生的情況和T細(xì)胞的凋亡情況,旨在探討大劑量過(guò)敏原誘導(dǎo)哮喘T淋巴細(xì)胞免疫耐受的基本機(jī)制。1材料和方法1.1細(xì)胞分離液和tunel試劑盒雞卵蛋白系Sigma公司產(chǎn)品,淋巴細(xì)胞分離液為上海試劑二廠產(chǎn)品,ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó),TUNEL試劑盒系Roche公司產(chǎn)品。1.2兩組患者ova的注射及激發(fā)健康雌性BALB/c小鼠60只,4～6周齡,體質(zhì)量21.3～23.6g,由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為兩組:①實(shí)驗(yàn)組:分別于第1、13天予OVA/Al(OH)3混合液0.1ml腹腔注射[內(nèi)含OVA10μg,Al(OH)31mg],第21～29天每天予2%OVA生理鹽水溶液霧化吸入激發(fā)30min或直至出現(xiàn)哮喘樣發(fā)作時(shí)為止。②對(duì)照組:用生理鹽水替代OVA腹腔注射及激發(fā)。每組30只小鼠,分5個(gè)處理濃度級(jí),每濃度級(jí)用6只小鼠。1.3調(diào)節(jié)性細(xì)胞rpmi在最后一次激發(fā)結(jié)束24h后,將小鼠脫頸椎致死,開(kāi)腹無(wú)菌取脾,常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞。2000r/min離心洗滌2次后,用含10%Fbs的RPMI1640培養(yǎng)液5ml重懸。將此細(xì)胞懸液加至玻璃培養(yǎng)皿中,置5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后取出,用尖吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液,使淋巴細(xì)胞吹脫,吸出懸液,用細(xì)胞刮刀將吸附在平皿表面的單核細(xì)胞刮離,洗滌后用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為4×105/ml。尼龍毛柱法提純T淋巴細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/ml。1.4ova鹽水利益檢測(cè)96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入兩實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞5×104/ml,單核細(xì)胞2×104/ml(共0.1ml),再分別加入終濃度為0.1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、10mg/ml的OVA生理鹽水溶液,空白對(duì)照組以0.1ml生理鹽水替代加入。每濃度組均設(shè)三復(fù)孔。置培養(yǎng)板于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后,取上清液測(cè)其IL-5水平;收集細(xì)胞行TUNEL染色檢測(cè)T細(xì)胞的凋亡情況。1.5抗體添加量按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。加100μl標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照、待測(cè)樣品和空白對(duì)照(樣品稀釋液)到已包被好的培養(yǎng)板孔內(nèi),37℃孵育90min;洗板,每孔加入50μl抗體,混合30s,37℃孵育60min;洗板,每孔加入50μl抗體,混合30s,37℃孵育60min;洗板,每孔加入50μl抗體,混合30s,37℃孵育60min;洗板,用50μl終止液終止顯色,10min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。1.6合成細(xì)胞劑3.按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。收集培養(yǎng)板中的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,0.01mol/LPBS漂洗5min,3次。0.1%TritonX-100,4℃通透2min。PBS漂洗5min,3次。0.03%H2O2/0.01%NaN3封閉30min。PBS漂洗5min,3次。加入由末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)、脫氧三磷酸核苷(dNTP)和熒光素標(biāo)記的脫氧三磷酸尿苷(dUTP)組成的TUNEL反應(yīng)混合液20μl/片,37℃反應(yīng)1h。PBS漂洗5min,3次。加入過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記的抗熒光素抗體20μl/片,37℃反應(yīng)30min。PBS漂洗5min,3次。0.05%DAB/0.01%H2O2顯色,光鏡下控制顯色深淺。蘇木精復(fù)染。脫水,透明,封片。計(jì)數(shù):在高倍光鏡下隨機(jī)選擇視野,計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算凋亡率。1.7統(tǒng)計(jì)處理用ˉx±sxˉ±s表示,采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和χ2檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1t細(xì)胞il-5表達(dá)變化隨著OVA濃度升高,哮喘組IL-5的水平亦明顯升高,至100μg/ml處理濃度級(jí)時(shí)IL-5水平達(dá)最高,但在10mg/mlOVA處理濃度級(jí),T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-5水平卻較其它幾個(gè)低濃度組明顯下降(P<0.01),甚至低于空白對(duì)照(P<0.01);對(duì)照組經(jīng)不同OVA濃度處理后T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-5水平?jīng)]有改變。見(jiàn)表1。2.2凋亡率的測(cè)定各濃度處理組T細(xì)胞行TUNEL染色,DAB顯色,呈棕黃色者即為凋亡細(xì)胞。各組分別隨機(jī)計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算凋亡率。凋亡率(%)=凋亡染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%結(jié)果見(jiàn)表2,哮喘組、對(duì)照組之間凋亡率無(wú)顯著差異(P>0.05),哮喘組、對(duì)照組內(nèi)不同處理濃度級(jí)之間凋亡率亦無(wú)明顯差異(P>0.05)。3大劑量工傷保護(hù)對(duì)t細(xì)胞il-5和th2細(xì)胞因子的抑制作用哮喘的發(fā)病可以在一定程度上視為一種免疫耐受機(jī)制缺陷的疾病,即正常人接觸過(guò)敏原后機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受,不會(huì)始動(dòng)哮喘的發(fā)病過(guò)程。相反,哮喘患者接觸過(guò)敏原后即可活化Th2細(xì)胞,始動(dòng)哮喘發(fā)病過(guò)程。過(guò)敏原的特異性免疫治療的經(jīng)驗(yàn)告訴我們,大劑量的過(guò)敏原可以導(dǎo)致患者對(duì)特異性過(guò)敏原在一定程度上的“免疫耐受”。所以,我們用不同劑量過(guò)敏原處理OVA特異性淋巴細(xì)胞,觀察大劑量過(guò)敏原對(duì)T細(xì)胞IL-5產(chǎn)生的影響及機(jī)制,了解特異性免疫治療的作用機(jī)制,為進(jìn)一步提高免疫治療的療效提供理論依據(jù)。Janssen等的研究報(bào)道肺引流淋巴結(jié)細(xì)胞予終濃度為10μg/ml的OVA體外處理后,其IL-5的產(chǎn)生水平達(dá)到1500pg/ml。我們利用高于該濃度1000倍的OVA體外處理哮喘小鼠脾臟T細(xì)胞,結(jié)果顯示,哮喘小鼠T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-5水平隨OVA處理濃度的增高而增高(P<0.01),至100μg/ml濃度級(jí)達(dá)最高值。但在10mg/ml的大劑量過(guò)敏原處理后哮喘T細(xì)胞IL-5的產(chǎn)生卻較幾個(gè)低濃度組顯著降低(P<0.01),甚至低于對(duì)照組IL-5的基礎(chǔ)分泌水平,此結(jié)果與Derry等所報(bào)道的基本一致。表明大劑量過(guò)敏原能抑制哮喘T細(xì)胞IL-5的產(chǎn)生,從而糾正Th1/Th2細(xì)胞因子的失衡。同時(shí)也提示,哮喘對(duì)過(guò)敏原的免疫耐受缺陷可能通過(guò)接觸大劑量的過(guò)敏原進(jìn)行糾正,使T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-5的恢復(fù)到正常的水平。IL-5是Th2細(xì)胞產(chǎn)生的代表性細(xì)胞因子,具有刺激哮喘患者骨髓的IL-5生成增多,趨化Eos在氣道內(nèi)的聚集,并活化Eos,在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此,大劑量過(guò)敏原抑制T細(xì)胞IL-5產(chǎn)生是SIT治療哮喘的機(jī)制之一。文獻(xiàn)報(bào)道,經(jīng)SIT治療的患者可出現(xiàn)抗原特異性Th2淋巴細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。Th2的凋亡使Th1/Th2細(xì)胞的失衡得到糾正,從而導(dǎo)致Th2細(xì)胞因子(如IL-5)的產(chǎn)生減少。在本試驗(yàn)中,我們同時(shí)檢測(cè)了T細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,不同濃度過(guò)敏原處理后T細(xì)胞的凋亡率沒(méi)有變化。其原因可能是過(guò)敏原與T細(xì)胞在體外培養(yǎng)的時(shí)間較短,T細(xì)胞尚未發(fā)生凋亡。而IL-5產(chǎn)生減少的原因可能是大劑量過(guò)敏原導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)不反應(yīng)性(Anergy)。在此情況下,抗原特異性T細(xì)胞雖未發(fā)生細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞數(shù)量減少,但T細(xì)胞處于對(duì)變應(yīng)原不反應(yīng)的狀態(tài),Th2細(xì)胞