cd4+cd25+foxp3+reg細胞在哮喘變應原霧化吸入減敏治療中的作用

cd4+cd25+foxp3+reg細胞在哮喘變應原霧化吸入減敏治療中的作用

氣管哮喘是一種由各種細胞和細胞組成的慢性呼吸道炎癥疾病。根據全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA),哮喘治療方案是以長期吸入糖皮質激素為主的抗炎治療。但糖皮質激素未能針對病因進行治療,持續(xù)應用會帶來一些不良反應。變應原免疫療法(AIT)對涉及Ⅰ型過敏反應的疾病有效。特異性變應原免疫治療被認為是唯一針對病因、改變哮喘自然病程的哮喘治療方法,常規(guī)以皮下注射方式減敏治療。在哮喘大鼠模型中用霧化吸入特異性變應原減敏,揭示該法具有臨床應用的良好基礎和可行性。調節(jié)性T細胞(Treg)具有免疫調節(jié)和免疫抑制作用,是哮喘發(fā)病機制中的重要細胞,CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在控制哮喘和過敏性疾病中起重要作用。我們主要探討特異性變應原霧化吸入減敏療法對過敏性支氣管哮喘的防治作用及與CD4+CD25+Foxp3+Treg的關系。1數(shù)據和方法1.1儀器、試劑和儀器PE-anti-humanCD25、PE-Cy5-anti-humanFoxp3、FITC-Anti-humanCD4及同型對照抗體(美國eBioscience公司),Intraprep透膜劑、流式細胞儀(美國Backmancoulter公司),佛波脂(PMA)、布雷菲德菌素A(BFA)、離子霉素Ionnmycin、莫能霉素Monensin(以上均為美國Sigma公司),阿羅格點刺液及阿羅格變應原(德國默克·阿羅格制藥有限公司),肺功能檢測儀(MasterScope,德國耶格公司)。1.2實驗方法1.2.1皮膚過敏原測試根據中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組制定的哮喘診斷標準,2011年1月-2011年12月在我院門診確診為慢性持續(xù)期、中度支氣管哮喘;粉塵螨、屋塵螨皮膚過敏原測試為陽性(強度≥+++);初診或3個月內未按GINA方案規(guī)范治療,排除有吸煙史,高血壓病、心臟病、肝或腎及其它肺疾患,1個月內有明顯呼吸道感染史者。收集患者40例,其中男性16例,女性24例,年齡19～50歲,平均年齡(32±9.6)歲。隨機分為常規(guī)治療組(A組)、吸入減敏組(B組),各20例。1.2.2霧化獨立獨立釋放所用患者填寫知情同意書,給予相同的基礎治療,即吸入替卡松/沙美特羅50/250μg,2次/d;可按需使用萬托林。B組按每周2次霧化吸入特異性變應原,持續(xù)6個月。以起始濃度(-3級)的最小劑量0.05ml加入5ml生理鹽水中,以后患者依次使用0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml的劑量加入5ml生理鹽水進行霧化吸入;每個濃度吸入6次,而后提高一個濃度級繼續(xù)上述方案。每次霧化吸入結束后留觀30min,觀察有無過敏反應,如出現(xiàn)立即停止本次治療,并在下次脫敏時降低變應原濃度。備地塞米松、腎上腺素等急救藥品和物品。A組霧化吸入以生理鹽水5ml代替,亦每周2次,持續(xù)6個月。治療前后取患者外周血。1.2.3哮喘常規(guī)量治療前和治療后分別參照文獻,采用哮喘控制測試(asthmacontroltest,ACT)來觀察哮喘患者的癥狀控制情況。1.2.4肺功能與呼吸道反應的測定在患者治療前、后進行,檢查前停用舒立迭24h,停用萬托林12h。1.2.5含離子霉素的大鼠血清的培養(yǎng)液含胎牛血清取外周血2ml,枸椽酸鈉抗凝,置于室溫。500μl抗凝血加入含25μlPMA,20μl離子霉素、20μlBFA、117μl莫能霉素,RPMI1640(含胎牛血清)培養(yǎng)液至1ml,混勻。置于37℃、50ml/LCO2培養(yǎng)4h。1.2.6pe-cy5-檢測細胞的生長將經活化的外周血標本加入1.5μlFITC-Anti-humanCD4,細胞均分為兩管(A、B),往A管中加入1μlPE-anti-humanCD25,B管加入相應同型對照抗體,孵育30min(4℃,避光)。洗滌2次,A管內加入Intraprep#1100μl、室溫暗處孵育15min,加入PBS液4mL,1500r/min,離心5min,棄上清,加入Intraprep#2100μl,室溫避光孵育5min。洗滌2次,將A管細胞均分為2管,分別加入2.5μlPE-Cy5-anti-humanFoxp3及等量PE-Cy5標記同型對照抗體,4℃、避光孵育30min。加入PBS液4mL洗滌,1500r/min離心5min,棄上清,溶血機溶血。洗滌2次后重懸細胞上機行流式檢測,FCSExpress軟件分析數(shù)據。1.3統(tǒng)計方法采用SPSS17.0軟件,計量資料以(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用t檢驗。兩樣本率的比較采用χ2檢驗。2結果2.1兩組治療前后t治療前A、B兩組哮喘控制評分比較,差異無統(tǒng)計學意義。治療后兩組哮喘控制評分均高于治療前,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.132,P<0.01;t=13.46,P<0.01);兩組治療后比較,B組評分明顯高于A組(t=2.701,P<0.05)。見表1。2.2兩組肺功能比較治療后B組氣道反應性較前降低,A組無明顯變化見表2。。治療后兩組肺功能均有明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(t=13.14,P<0.01;t=22.37,P<0.01),但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。2.3+t細胞占cd4+t細胞比例治療后B組外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞占CD4+T淋巴細胞百分比明顯高于治療前(t=12.62,P<0.01),高于A組(t=12.12,P<0.01)。見表1。3cd4+cd25+treg細胞在外周血和體內表達的變化變應原特異免疫療法(AIT)又稱脫敏療法(desensitization),被認為是目前臨床上可以改變過敏性疾病自然進程的唯一治療方法。AIT可以減輕炎癥,降低非特異性氣道高反應性,并且預防新的過敏反應發(fā)生,對過敏性鼻炎患者的AIT治療,可以預防患者發(fā)生過敏性哮喘。AIT治療可降低Th2型細胞因子,升高抗炎因子如IL-10和TGF-β的水平,并提高Treg細胞的數(shù)量或活性,從而降低了過敏性免疫反應。還可能降低特異性IgE抗體的產生,而提高特異抗原的IgG型阻滯抗體的產生。CD4+CD25+Treg屬于天然調節(jié)T細胞(nTreg),是Treg的主要組成部分,Foxp3特異性地高表達于CD4+CD25+Treg,參與其發(fā)育、分化,與其抑制功能相關。CD4+CD25+Treg數(shù)量減少和Foxp3表達減少在哮喘的Th1/Th2失衡中扮演重要角色。FrancisJN等的研究表明特異性免疫治療誘導產生IL-10的Treg增加,從而抑制過敏性疾病的炎癥反應。分泌產生IL-10的調節(jié)性T細胞是屬于誘導性調節(jié)T細胞(iTreg)的一類Treg亞群,一般稱為Tr1細胞。本研究結果顯示,哮喘患者經特異性變應原霧化吸入減敏后哮喘控制測試評分升高,