阿膠的主要成分及質(zhì)量控制研究進展

阿膠的主要成分及質(zhì)量控制研究進展

coracoriiasi是馬科動物的皮。它是在浸泡和去除泡沫后制成的。與人參、鹿茸并稱“中藥三寶”,因補血健身效果明顯,有補血“圣藥”之稱。能補血滋陰、潤燥止血,用于血虛萎黃、眩暈心悸、肌痿無力、心煩不眠、肺燥咳嗽、吐血尿血、先兆流產(chǎn)、便血崩漏、妊娠胎漏,是中醫(yī)臨床常用的補益藥。現(xiàn)代藥理研究表明阿膠對缺血性動物的紅細胞、血紅蛋白及紅細胞壓積有顯著的促進作用,可以明顯增強造血功能,升高白細胞的數(shù)量。免疫學實驗發(fā)現(xiàn)阿膠對放療病人淋巴細胞的促進作用明顯,能消除放療對免疫系統(tǒng)的抑制作用,增加腫瘤壞死因子的數(shù)量,有顯著的免疫作用和抗癌作用。目前對阿膠的研究多集中在藥理方面,為阿膠新用途的開發(fā)奠定了基礎,但是對阿膠質(zhì)量控制的研究相對較少。在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下,不法分子以劣質(zhì)阿膠、雜皮膠、黃明膠(牛皮膠)等冒充正品阿膠的事件屢見不鮮,給阿膠的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量控制提出了新的挑戰(zhàn)。阿膠的傳統(tǒng)鑒別方法主要為性狀鑒別(顏色、氣味、形狀、口感、質(zhì)地等)和理化鑒別(火試、水試等)。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的分析儀器被應用于阿膠的質(zhì)量控制研究,使阿膠的質(zhì)量控制標準更加科學合理。1膠原蛋白等物質(zhì)的測定阿膠的組成部分既有大分子的蛋白質(zhì),又有小分子氨基酸和無機鹽,也有不溶性物質(zhì)。大量研究表明阿膠由蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸、生物堿以及多種微量元素組成。阿膠是由膠原蛋白等物質(zhì)的水解產(chǎn)物組成,因此其主要成分是蛋白質(zhì),含量約為60%~80%,凝膠電泳結(jié)果表明阿膠中主要蛋白質(zhì)的等電點集中在4.6~4.8,分子量在2~24萬均有分布。阿膠中的氨基酸也是來自膠原蛋白的水解,共十七種(包括人體必需七種氨基酸),含量以甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和精氨酸為主要氨基酸,均占總氨基酸含量的7.0%以上,阿膠中含有國際上公認的對人體有益的全部16種微量元素,主要有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅、鋁、錳、鋅、鉻、鉑、鉬、鍶等,阿膠的許多藥理作用都與它們有關(guān)。針對阿膠的組成,研究人員從不同的方面建立研究方法。2蛋白質(zhì)含量的測定半透膜透析是一種可逆的動態(tài)平衡,平衡時膜內(nèi)外兩邊的滲透壓相等,是蛋白類藥物研究的最基本方法。如葛正華利用半透膜滲析法分離阿膠中的蛋白及小分子物質(zhì),以已知質(zhì)量的濾紙過濾半透膜中的液體,烘干濾紙得不溶物的質(zhì)量,并通過Langmuir方程外推法確定可以滲析出的小分子物質(zhì)全部量,從而確定蛋白質(zhì)的含量。劉穎等采用分級過濾法,其原理歸結(jié)于半透膜滲析法,分離出阿膠的有效成分進行測定,結(jié)果表明阿膠中的蛋白質(zhì)含量在60%以上。同時該實驗采用毛細管粘度計測定純水的粘度和定容后膠液的粘度,用“一點法”確定膠液的特性粘度,從而計算出蛋白類的粘均分子量在22~24kD。3蛋白質(zhì)及多肽的穩(wěn)定性隨著蛋白質(zhì)組學的誕生及發(fā)展,阿膠中蛋白質(zhì)的研究也隨之進入了新的階段。王若飛等人就從蛋白質(zhì)組學的角度對阿膠中所含的蛋白質(zhì)及多肽進行了研究,試驗過程中以硫酸銨沉淀、透析脫鹽凍干法獲得阿膠中的水溶性蛋白及多肽,采用CiphergenBiosystemsInc.ProteinChipBiologySystem(美國PBSⅡ+)及配套的NP10芯片、激光解析/離子化-飛行時間質(zhì)譜技術(shù),分析阿膠Mr1500~13000區(qū)間蛋白質(zhì)、肽分布及其相對分子質(zhì)量。測定四個不同質(zhì)量濃度的樣品,穩(wěn)定獲得的有意義蛋白及多肽共計9個。不同相對分子質(zhì)量肽之間差為71.7,88.4,148.9,分別提示可能為丙氨酸殘基(Mr71.08)、絲氨酸殘基(Mr87.08)、苯丙氨酸殘基(Mr147.18)的相對分子質(zhì)量。4動物膠的種類蛋白質(zhì)作為阿膠的重要藥效成分,也是為阿膠區(qū)別于其它動物膠的特征成分之一。如李鋒等以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別阿膠、鹿角膠、龜板膠、鱉甲膠、海龍膠、雜皮膠、魚鱗膠七種動物膠,不同來源的膠類藥材電泳圖譜明顯不同,尤其是常充阿膠的雜皮膠與正品阿膠相比,不僅譜帶數(shù)目少,而且泳動率差異也較大。其它幾種膠雖有1條或2條相近的譜帶,但尚有各自特征的鑒別譜帶。5氨基酸的測定《中國藥典》2005年版(一部)中增加了薄層色譜鑒別項,以甘氨酸為對照品鑒別阿膠水解得到的甘氨酸。趙曦等通過比較測定30種阿膠,發(fā)現(xiàn)按《中國藥典》1995年版一部(附錄ⅨL)測定阿膠及偽品膠的總氮量無顯著性差異,而采用酸堿滴定法測定結(jié)果顯示阿膠中的氨基氮含量遠高于偽品中的含量。因此,實驗者提示以氨基氮含量>0.6%來控制阿膠的質(zhì)量。6氨基酸的分離王曉坤等人對阿膠水溶性成份進行了HPLC分析,以萃取的方法提取阿膠中的水溶性成份,水-乙腈梯度洗脫,經(jīng)C18色譜柱分離出28個共有峰,液-質(zhì)聯(lián)用分析確定了5個成分分別為游離的異亮氨酸,亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。阿膠系由膠原水解得到的膠原蛋白及多種氨基酸。阿膠中游離的氨基酸含量較少,而膠原蛋白水解后可得到18種氨基酸(包括7種人體必需氨基酸),且含量相對較高。因此,不少研究人員將研究重點放在了蛋白水解后得到的氨基酸上。鄢丹等反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定阿膠中的17種未衍生氨基酸,采用PrevailC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈-0.7%三氟醋酸溶液(含5.0mmol·L-1七氟丁酸)為流動相進行線性梯度洗脫,流速為0.8mL·min-1,在漂移管溫度115℃、氮氣流量2.5L·min-1條件下,25min內(nèi)即可完成對阿膠中17種氨基酸的分離測定。該研究對阿膠中氨基酸的組成及含量進行了分析,分離測定了17種氨基酸的含量,其總含量大于50%。7氨基酸及硫酸皮膚素的含量及其組成生物體內(nèi)的微量元素是指含量占生物體總質(zhì)量0.01%以下的元素。微量元素在人體內(nèi)的含量雖少,但在生命活動中的作用卻是十分重要的。隨著實驗研究的深入和分析手段的提高,人們逐漸認識到中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎除了有機成分外,微量元素也是其重要有效成分之一。因此,中藥微量元素的測定和鑒別至關(guān)重要。黃必勝采用原子吸收光譜法測定了阿膠、龜板膠、鹿角膠三種膠種Zn,Cu,Fe,Mn四種元素的含量。樣品處理方法采用干灰化法,用高純鹽酸溶解殘渣,高純水稀釋,定容,測定各樣品的原子吸收光譜。中醫(yī)理論認為人的氣、血、精液與元素Zn,Cu,Fe,Mn的關(guān)系較大。三種膠的測定結(jié)果表明,阿膠中鐵的含量最高,與其補血的功效一致。王文靜等以X射線熒光光譜法測定了6個產(chǎn)地的阿膠中微量元素(元素測定范圍B~U)的含量。其中三種與對照品的元素特征譜基本一致,而另外兩種阿膠中含有的Cr,Cl,Na和K遠高于對照品中四種元素的含量,實驗者認為出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是在熬制阿膠過程中摻入制革的碎雜皮所引入的。硫酸皮膚素是一類結(jié)構(gòu)復雜、硫酸化的糖胺聚糖,除了具有抗血栓作用外,還具有抗炎癥、抗腫瘤、抗感染和損傷修復等作用?，F(xiàn)代研究認為阿膠中除了含有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、微量元素外,還含有具有多種藥理作用的硫酸皮膚素。90年代初期,樊給曾等人就關(guān)注過阿膠中硫酸皮膚素的研究。該實驗同時鑒別和測定了阿膠及驢皮中的硫酸皮膚素及其含量,試驗采用酶解的方法獲得硫酸皮膚素,以電泳法對其進行鑒別。酶解液經(jīng)染料天青I染色后,采用分光光度法在536nm處測其吸收度,進而計算含量。隨著計算機軟件技術(shù)的發(fā)展,科研工作者開發(fā)了多種用于中藥分析的統(tǒng)計軟件,這使得中藥的分析更加科學合理。目前,運用于中藥圖譜分析的統(tǒng)計軟件主要包括SAS、Stata和SPSS、MATLAB及中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)等,主要應用的模式識別方式包括聚類分析、主成分分析、距離判別分析、相似度分析、神經(jīng)網(wǎng)絡等。近幾年,從事阿膠鑒別及質(zhì)量控制的研究人員,將這些軟件技術(shù)引入到阿膠的研究中,取得了一定的成果。屈凌波等采用模糊神經(jīng)網(wǎng)絡處理阿膠的識別,提取10個圓二色光譜譜圖特征及1個旋光度數(shù)據(jù),所得到的結(jié)果是樣本對于某類的隸屬度,可以將混合樣本進行科學的歸屬,對于可能存在的混合樣本進行正確的評價。結(jié)果表明網(wǎng)絡訓練后能把一些混合膠樣品隸屬于何種膠的隸屬度識別出來,從而確定混合膠的歸屬。瞿海斌等采用近紅外漫反射光譜法結(jié)合主成分分析、NIR光譜相似度匹配法、主成分得分馬氏距離法鑒別阿膠真?zhèn)?。對?jīng)預處理后的阿膠NIR譜圖進行主成分分析,8個真品阿膠聚集在某個范圍內(nèi),表明其產(chǎn)品質(zhì)量比較穩(wěn)定。而偽品阿膠散落在圈定的范圍之外,表明真?zhèn)纹钒⒛z之間存在著明顯的差異。8制約膠質(zhì)管理體系的研究阿膠作為一種有著幾千年用藥史的傳統(tǒng)中藥,其藥效在國內(nèi)已得到了廣泛的認可,經(jīng)濟效益不可小覷。如何讓阿膠走出國門,打入