基因工程的基本操作程序課件高二上學(xué)期生物人教版選擇性必修

理論基礎(chǔ)DNA是遺傳物質(zhì)的證明DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立遺傳密碼的破譯技術(shù)保障基因工程工具的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA連接酶基因載體(如質(zhì)粒)一、基因工程的誕生和發(fā)展二、基因工程的概念

基因工程是指在生物體外，通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，使重組基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)?；蚬こ逃址QDNA重組技術(shù)?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平原理基本過(guò)程結(jié)果DNA重組技術(shù)體外基因DNA分子水平基因重組剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)人類需要的基因產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)定向改造生物性狀克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，育種周期短（一）限制性核酸內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）含義：主要從原核生物中分離得到來(lái)源：磷酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵

作用部位：有專一性(特異性)。即一種限制酶只能識(shí)別一種特定核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。作用特點(diǎn)：產(chǎn)生黏性未端、平末端

作用結(jié)果：小結(jié)識(shí)別序列長(zhǎng)度：大多數(shù)是6個(gè)核苷酸序列三、基因工程的工具（二）DNA連接酶——“分子縫合針”1.作用：CGGCCGTTAAAATTGCTATA具有相同黏性末端的兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)，形成重組DNA分子。3.結(jié)果：

將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵（無(wú)特異性）。作用原理：催化磷酸二酯鍵的形成DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象

作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要模板需要DNA的一條鏈為模板形成完整的DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個(gè)脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵1.作用：2.種類：（三）基因進(jìn)入細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車作為運(yùn)載工具，將外源基因送入受體細(xì)胞。質(zhì)粒（最常用）、λ噬菌體的衍生物和某些動(dòng)植物病毒3.條件：⑴能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存⑵有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，可使外源基因插入其中⑶具有某些遺傳標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。⑷對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害

(5)大小適宜

實(shí)際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蚧蚬こ蘐hebasicoperatingproceduresofgeneticengineeringy從社會(huì)中來(lái)Fromsociety普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲棉將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉花我國(guó)是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。棉花在種植過(guò)程中，常常會(huì)受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見(jiàn)。如何能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種呢？從社會(huì)中來(lái)Fromsociety培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡(jiǎn)要過(guò)程蘇云金桿菌

普通棉花（無(wú)抗蟲特性）

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取（核心）Bt基因基因工程的實(shí)施過(guò)程獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的基因檢測(cè)和鑒定目的基因一、獲得目的基因人們感興趣而需要的特定基因，也叫外源基因。2.獲取目的基因的方法：①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲?、诶肞CR技術(shù)擴(kuò)增

③人工合成1.目的基因：基因較小，核苷酸序列已知基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段AgeneisusuallyapieceofDNAthathasageneticeffectDNA片段基因1基因2基因3放大非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。非編碼區(qū)：不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列①不編碼蛋白質(zhì)。②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子信使RNA成熟的信使RNA終止子轉(zhuǎn)錄剪切拼接翻譯蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)錄法構(gòu)建的真核生物的CDNA文庫(kù)里不含啟動(dòng)子和終止子真核細(xì)胞基因編碼區(qū)中的內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，但表達(dá)時(shí)是否轉(zhuǎn)錄？將此mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，那么合成的這個(gè)DNA與原來(lái)的DNA是否一樣？1、從基因文庫(kù)中獲?。?）基因文庫(kù)的概念:

先用酶切等方法將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA片段切割成大小合適的片段，再將這些片段分別與載體連接起來(lái),導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)（2）

基因文庫(kù)的種類:基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部

分基因，如：cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)VScDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組文庫(kù)中的真核基因含有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞沒(méi)有內(nèi)含子剪切系統(tǒng)，所以基因組文庫(kù)中的真核基因不易在原核細(xì)胞中正常表達(dá)。動(dòng)植物細(xì)胞的內(nèi)含子剪切系統(tǒng)也有差異，所以動(dòng)物基因組文庫(kù)中的基因不易在植物細(xì)胞中正常表達(dá)，反之亦然。思考、為什么基因組文庫(kù)中只有部分基因可以在物種間進(jìn)行基因交流？例題：下列關(guān)于cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的說(shuō)法中，不正確的是

(

)A．cDNA文庫(kù)中只含有某種生物的部分基因，基因組文庫(kù)中含有某種生物的全部基因B．如果某種生物的cDNA文庫(kù)中的某個(gè)基因與該生物的基因組文庫(kù)中的某個(gè)基因控制的性狀相同，則這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)也完全相同C．cDNA文庫(kù)中的基因沒(méi)有啟動(dòng)子D．一種生物的cDNA文庫(kù)可以有許多種，但基因組文庫(kù)只有一種B2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PCR簡(jiǎn)介

1.概念：PCR全稱為_(kāi)______________，

是一項(xiàng)在生物__復(fù)制____

_______的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段2.原理：利用

的原理，將基因的核苷酸序列不斷加以復(fù)制，使其數(shù)量呈

方式增加。DNA雙鏈復(fù)制指數(shù)PCR技術(shù)—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)3.過(guò)程變性退火延伸_____________________目的基因的篩選與獲取——PCR的過(guò)程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR第1步：變性5

′-3

′--3

′-5

′5

′-3

′--3

′-5

′當(dāng)溫度為94℃時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈。5

′--3

′-5

′3

′-第2步：復(fù)性當(dāng)溫度下降到55℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。目的基因的篩選與獲取——PCR的過(guò)程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR5

′--3

′-5

′3

′-第2步：復(fù)性什么是引物？為什么需要引物？目的基因的篩選與獲取——PCR的過(guò)程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR5

′--3

′-5

′3

′-第3步：延伸5

′--3

′-5

′3

′-5

′--3

′-5

′3

′-當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。目的基因的篩選與獲取——PCR的過(guò)程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’變性（解旋為單鏈）退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈）重復(fù)循環(huán)3.過(guò)程聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——過(guò)程歸納Polymerasechainreaction——Theprocessofinduction4.條件模板引物脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合緩沖Taq酶激活劑5.前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。6.結(jié)果：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。DNA在體內(nèi)的半保留復(fù)制

條件：模板、原料、能量、酶

模板：DNA的兩條鏈（母鏈）

原料：四種游離的脫氧核苷酸

能量：一般由ATP

酶：解旋酶、DNA聚合酶

特點(diǎn)：半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制復(fù)習(xí)：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR和DNA的體內(nèi)復(fù)制是否完全相同？PCR技術(shù)DNA復(fù)制原則原料條件解旋方式場(chǎng)所酶特點(diǎn)結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、引物、酶等DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋體外主要在細(xì)核胞內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子PCR技術(shù)擴(kuò)增與細(xì)胞中DNA復(fù)制的比較半保留復(fù)制、全解旋再?gòu)?fù)制半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制

在80-100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)。

當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。PCR技術(shù)中，解開(kāi)雙鏈沒(méi)有用解旋酶，而是利用的DNA的熱變性和復(fù)性的原理。變性：復(fù)性：目的基因的篩選與獲取Screeningandacquisitionoftargetgenes3.人工合成法（1）前提：（2）方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因目的基因的篩選與獲取——人工合成DNA目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成反轉(zhuǎn)錄法：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成歸納3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________獲取目的基因的三種方法1、如果知道目的基因兩端的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用____________

2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用________________PCR技術(shù)擴(kuò)增化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因文庫(kù)，再?gòu)幕蛭膸?kù)中獲取1、PCR技術(shù)是一種DNA的擴(kuò)增技術(shù)。在一定條件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。據(jù)此判斷不合理的是

（

）

A．dATP在DNA擴(kuò)增中可以提供能量，同時(shí)作DNA合成的原料B．dTTP完全水解后產(chǎn)物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖C．DNA擴(kuò)增過(guò)程未加解旋酶，可以通過(guò)先適當(dāng)加溫的方法破壞氫鍵，使模板DNA解旋D．CTP水解脫去兩個(gè)磷酸基后是組成RNA的基本單位之一

B例題2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫(kù)中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D(zhuǎn)例題3、下列有關(guān)PCR技術(shù)的說(shuō)法，不正確的是

(

)A．PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)B．PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制C．利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列D．PCR擴(kuò)增中需要解旋酶解開(kāi)雙鏈DNAD例題4、下列有關(guān)獲取目的基因方法的敘述，錯(cuò)誤的是(

)A．直接分離目的基因的方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是工作量大，具有一定的盲目性B．由于真核細(xì)胞的基因含有不表達(dá)的DNA片段，一般使用人工合成的方法C．目前人工合成基因的方法主要有兩種，分別是反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法D．PCR技術(shù)的原理是DNA復(fù)制，需要RNA聚合酶催化DNA合成D步驟獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體(核心)導(dǎo)入目的基因檢測(cè)和鑒定目的基因1.2.3.4.1目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因等構(gòu)建基因表達(dá)載體——核心步驟啟動(dòng)子首端RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止子尾端RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄標(biāo)記目的基因基因表達(dá)載體的組成：一般用同一種

酶分別切割載體和目的基因，再用

酶把兩者連接(如圖)。限制DNA連接基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程：缺點(diǎn)1：質(zhì)粒自身環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接【討論】如果只用一種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶處理后會(huì)出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？a、b、c、d四個(gè)黏性末端相同。思考分析——單酶切的缺點(diǎn)Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestion缺點(diǎn)2：目的基因自身環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接思考分析——單酶切的缺點(diǎn)Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestionabcd限制酶切割DNA連接酶連接反向連接重組DNA缺點(diǎn)3：目的基因與質(zhì)粒反向連接，造成目的基因不能正確表達(dá)。思考分析——雙酶切用兩種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段重組質(zhì)粒限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd黏性末端a與c相同；黏性末端b與d相同。思考分析——雙酶切Thinkinganalysis——Doubleenzyme限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd質(zhì)粒不會(huì)重新環(huán)化目的基因不會(huì)被環(huán)化優(yōu)點(diǎn)1優(yōu)點(diǎn)2優(yōu)點(diǎn)3目的基因與質(zhì)粒不會(huì)發(fā)生反向連接確保目的基因與運(yùn)載體定向連接，減少重組雜物。習(xí)題鞏固——用限制酶切割時(shí)需注意的事項(xiàng)Exercisestoconsolidate——Pointsneedingattentionwhencuttingwithrestrictionenzyme(1)獲取目的基因和切割載體時(shí),通常使用同種限制酶,目的是為了

。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生

以及

，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

。產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接目的基因與質(zhì)粒反向連接目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體(2)獲取一個(gè)目的基因需限制酶切割

次,

共產(chǎn)生

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。兩4習(xí)題鞏固——用限制酶切割時(shí)需注意的事項(xiàng)Exercisestoconsolidate——Pointsneedingattentionwhencuttingwithrestrictionenzyme(3)選擇限制酶切割位點(diǎn)的基本原則：①切割目的基因時(shí)：

。②切割質(zhì)粒時(shí)：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，便于篩選基因表達(dá)載體的構(gòu)建Constructionofgeneexpressionvector1.下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，

錯(cuò)誤的是(

)A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)解旋C.體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量D.二者遵循的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相同B基因表達(dá)載體的構(gòu)建Constructionofgeneexpressionvector2.下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是()A.啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼B.啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C.標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D.基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別A步驟獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的基因檢測(cè)和鑒定目的基因1.2.3.4.(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）受體細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞（大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等）。（二）方法：(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：將目的基因?qū)?/p>

和裸子植物時(shí)最常用的方法。雙子葉植物1.導(dǎo)入植物細(xì)胞（二）方法：a.土壤農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：植物體受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量的

化合物，吸引農(nóng)桿菌侵染，其

質(zhì)粒上的

(可轉(zhuǎn)移的DNA)可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞的

上。

酚類TiT-DNA染色體的DNAb.方法步驟：

插入Ti質(zhì)粒的

上→轉(zhuǎn)入

→導(dǎo)入植物細(xì)胞→目的基因插入植物細(xì)胞中的

上→目的基因表達(dá)。目的基因T-DNA農(nóng)桿菌染色體的DNA核心歸納1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中兩次拼接、兩次導(dǎo)入的辨析(1)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。(2)兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是將含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。②基因槍法：將目的基因?qū)?/p>

植物常用的方法。表達(dá)載體DNA包裹在微小的金粉粒子或鎢粉粒子表面→用基因槍高速射入_________或組織中→目的基因表達(dá)。單子葉受體細(xì)胞③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助

進(jìn)入受體細(xì)胞?；ǚ酃芡ǖ乐参锏捏w細(xì)胞花粉卵細(xì)胞精子花粉管子房壁（1）番茄為什么通常容易軟化？抗軟化番茄的抗軟化機(jī)理是什么？抗軟化番茄的培育

（2）在該項(xiàng)目中，目的基因是什么？其載體是什么？（3）該培育過(guò)程運(yùn)用到哪些生物學(xué)技術(shù)？2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①方法：感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法（Ca2+處理法）②受體細(xì)胞：常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最廣泛。優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、易于培養(yǎng)。Ca2+處理大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞③過(guò)程：感受態(tài)細(xì)胞和重組表達(dá)載體DNA分子在

中混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子。緩沖液受體細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞的DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個(gè)體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子①②③方法：利用標(biāo)記基因（抗生素抗性基因）進(jìn)行篩選。篩選含有目的基因的受體細(xì)胞步驟獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體(核心)導(dǎo)入目的基因檢測(cè)和鑒定目的基因1.2.3.4.(1)檢測(cè)目的基因是否插入受體細(xì)胞的DNA中：