多肽的分離純化技術(shù)進展

多肽的分離純化技術(shù)進展

多孔藥物在臨床上顯示出很大的應(yīng)用價值，越來越受藥物固有的影響。多孔藥物的研究和開發(fā)已成為國際藥物競爭的重要方面。化學(xué)合成的肽產(chǎn)品是一個純度不好的粗產(chǎn)品,其一是因為在合成肽過程中各種副反應(yīng)、消旋化等造成的副反應(yīng)肽,二是在脫保護過程中,由于保護基的殘留,肽鍵的斷裂、烷基化等造成的雜質(zhì)。雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與合成肽很相似,或許二者之間僅僅在某一個位置的氨基酸殘基不同,或許二者之間的差異僅僅在某一氨基酸殘基側(cè)鏈上某一基團是否存在等等。由于雜質(zhì)與合成的肽在分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)上如此相似,就給肽的分離純化帶來了困難。因此,根據(jù)對目的肽的要求,需要選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行純化。高效液相色譜(HPLC)是生物技術(shù)中分離純化的重要方法,在多肽、蛋白質(zhì)的分離純化工藝中顯示出優(yōu)異的性能。而且,它已走出實驗室投入到大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中,成為生物技術(shù)范圍內(nèi)一有力高效的分離工具。目前用于分離純化合成多肽的HPLC模式主要有三種:一是凝膠過濾色譜,按照肽分子的大小進行分離,二是離子交換色譜,按肽分子所具有的帶電基團的性質(zhì)和數(shù)目進行分離;三是反相色譜,按照肽分子的疏水性強弱進行分離。1凝膠色譜測定凝膠色譜(GelFiltrationChromatography,GFC)是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),根據(jù)多肽分子的大小、形狀差異進行分離的一種方法。如人重組生長激素(hGH)的分離,不同結(jié)構(gòu)、構(gòu)型的GH在GFC柱上的分離行為完全不同,從而可分離不同構(gòu)型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體。凝膠象分子篩一樣,將大小不同、形狀各異的分子進行分離,因此凝膠色譜又叫分子篩層析或稱尺寸排阻色譜。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。凝膠色譜具有很多優(yōu)點:介質(zhì)為不帶電荷的惰性物質(zhì),不與溶質(zhì)分子作用,因此分離條件溫和,產(chǎn)品收率高,生物活性好;工作范圍廣,分離分子量的覆蓋面大,可分離從幾百至數(shù)萬分子量的分子。Wang等利用高效凝膠過濾色譜法測定了玉米蛋白酶解產(chǎn)物寡肽的分子量分布;設(shè)備簡單,易于操作,周期短,每次分離之后不需再生故而可繼續(xù)使用,有的連續(xù)使用幾百次甚至達千次。這些優(yōu)點使凝膠色譜已成為一種通用的分離方法,在多肽合成制備技術(shù)中獲得廣泛應(yīng)用,促腎上腺皮質(zhì)激素的多肽片段就是應(yīng)用SephadexG-50分離制備的。凝膠過濾色譜在脫鹽操作及逐步接肽和片段縮合反應(yīng)的分離中尤其重要。Ljevakovic等采用凝膠過濾色譜SephadexG-25和SP-SephadexC-25離子交換色譜,對合成的肽聚糖單體衍生物進行了分離純化。Heller等合成了具有生物學(xué)活性的鮭魚降鈣素類似物,為便于受體篩選研究,將多肽進行放射性標(biāo)記,標(biāo)記的多肽經(jīng)過GFC和反相HPLC的純化,用于研究降鈣素多肽與受體的作用機制。凝膠色譜的主要產(chǎn)品有Sephadex系、Sepharose系、Bio-GelA系、Bio-GelP系、Sephacryl系、Superdex系及Bio-BeadsS-X系等。2利用固相或漢語進行分離離子交換色譜(IonExchangeChromatography,IEC)是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換,而達到分離目的的方法。該法主要依賴電荷間的相互作用,利用帶電分子中電荷的微小差異進行分離,且有較高的分離容量。幾乎所有的生物大分子都是極性的,都可使其帶電,所以離子交換法已廣泛用于生物大分子的分離純化。由于離子交換色譜分辨率高、工作容量大且易于操作,它已成為蛋白質(zhì)、多肽、核酸及大部分發(fā)酵產(chǎn)物分離純化的一種重要方法,在合成多肽分離中約有75%的工藝采用離子交換色譜。在α-黑素細胞增長激素和促腎上腺皮質(zhì)激素多肽的合成中,就是應(yīng)用羧甲基纖維素進行分離的。王賢純等利用IEC比較研究了固相化學(xué)合成的多肽類神經(jīng)毒素虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)與其對應(yīng)的天然產(chǎn)物的色譜行為差異及分離純化方法。推測除了在合成HWTX-Ⅰ復(fù)性過程中有少數(shù)分子發(fā)生二硫鍵錯配外,還有部分分子在固相合成中發(fā)生了消旋作用,需要交替采取多種色譜法才能完全分離純化復(fù)性后的合成多肽產(chǎn)物。IEC可在中性條件下,利用多肽的帶電性不同分離純化化學(xué)合成的多肽。要獲得優(yōu)良的分離結(jié)果,必須選用適合的離子交換劑,如離子交換劑的種類、交換功能基的強弱。離子交換柱可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類,還有一些新型樹脂,如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質(zhì)的分離純化中,還應(yīng)進一步確定適用的pH值和洗脫條件,尤其是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。線性離子濃度梯度洗脫是最基本的洗脫方式,通常多肽的濃度洗脫采用在磷酸鹽、Tris或檸檬酸緩沖液的流動相中改變氯化鈉或氯化鉀的濃度以達到洗脫的目的。Huang等報道,利用離子交換色譜法,探討純化合成胸腺素α1的條件,獲得了有價值的數(shù)據(jù)供該物質(zhì)的放大生產(chǎn)。在制備性的純化中,使用大容量的制備型離子交換柱也十分方便,而且效率很高。對多肽分子進行分離純化可采用兩種方式,一是將目的產(chǎn)物離子化,被交換到介質(zhì)上,雜質(zhì)不被吸附,從柱流出,稱為“正吸附”。此法優(yōu)點是目的產(chǎn)物純度高,且可達到濃縮目的,宜處理目的產(chǎn)物濃度低且工作液量大的溶液。另一方式是將雜質(zhì)離子化后被交換,而目的產(chǎn)物不被交換直接流出,這種方式稱為“負吸附”。采用此法通?？沙?0%~70%的雜質(zhì),適用于目的產(chǎn)物濃度高的工作液。以上兩種方式的選擇要依據(jù)樣品及具體要求而定。無論是正吸附還是負吸附,離子交換色譜均已成為多肽化學(xué)中一重要的分離方法。3檢測rp-hplc分離分離多肽的方法反相高效液相色譜(Reversed-phaseHigh-performanceChromatography,RP-HPLC)具有十分高的分辨力,分離對象幾乎覆蓋了所有類型的化合物。由于可使用揮發(fā)性沖洗劑作為流動相,所以這種色譜不僅適用于分析型的實驗,還適用于制備型的分離。反相色譜利用非極性的反相介質(zhì)為固定相,極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液作為流動相進行溶質(zhì)的洗脫分離,是根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行分離純化的洗脫色譜法。RP-HPLC主要用于分子量低于5000,尤其是1000以下的非極性小分子多肽的分析和純化,分離多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。李順子等應(yīng)用反相高效制備液相色譜法,對5種合成的蜂毒肽類似物進行了分離制備。當(dāng)用極性較強的洗脫液做流動相時,主峰的保留時間短,且主峰和前后的雜質(zhì)峰不能很好的分開;隨著洗脫液極性減弱至某一值時,主峰和雜質(zhì)峰的保留時間均向后延長,且時間間隔加大,可以成功地對多肽樣品進行分離制備。用多肽分子中各氨基酸保留常數(shù)加和值的方法可以預(yù)測不同多肽的保留時間,為選擇分離純化多肽所需的流動相提供了參考作用。經(jīng)半制備分離純化后的產(chǎn)物用分析型RP-HPLC測定達到了很高的純度,氨基酸分析結(jié)果表明得到了所需的肽段,可用于下一步的研究工作。目前RP-HPLC分離柱仍然是以硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主體。尤其是鍵合C18(Octadecylsilica,ODS)、C8烷基以及苯基填料的出現(xiàn),使該技術(shù)得到長足發(fā)展。這類填料的最大特點是顆粒剛性好,有利于傳質(zhì),可以得到很高的柱效,并有良好的選擇性。硅膠基質(zhì)填料的pH值適應(yīng)性一般均限制在2~8。高分子基質(zhì)的RP-HPLC填料,目前較為廣泛使用的是微球形交聯(lián)聚苯乙烯樹脂。這類樹脂的表面具有烷基鍵合相那種非極性的特征,因此無須化學(xué)改性即可直接用作RP-HPLC的填料,如TSKgelOctadecyl-4PW和TSKgelOctadecyl-NPR。4人甲狀旁腺素的分離純化以上提到的分離多肽的技術(shù)在實際應(yīng)用過程中多相互結(jié)合,根據(jù)合成多肽性質(zhì)的不同,采用不同的分離純化手段。正確的實驗設(shè)計是選用最少的分離步驟達到最佳的分離效果。因為每一步的分離過程中總有部分樣品不可避免地損失掉,尤其是肽的濃度非常低時,應(yīng)盡量避免分離步驟過多。周賀鉞等應(yīng)用固相方法合成了人甲狀旁腺素,合成的多肽用三氟乙酸處理,從Wang樹脂上切除。所得粗肽用SP-Sepharose-FF色譜柱和半制備型高效液相色譜進行二步分離純化。分離結(jié)果經(jīng)鑒定純度在92%以上,通過電噴霧質(zhì)譜法測定其分子量與計算值相符為4116D,總收率為8%。另外,高效液相色譜法如果與其它分離純化多肽的方法如電泳聯(lián)合使用,將得到更好的分離效果。Sanz-Nebot等采用反相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用的方法與毛細管電泳(CE)聯(lián)合,對合成的促性腺素釋放激素類似物leuprolide的粗品進行分離和分析?；旌衔锵炔捎肔C-MS進行分析和部分收集,收集的組分隨后用CE進一步分離純化,兩種正交方法的聯(lián)用突出了各自的選擇性,產(chǎn)品純度高。5生物技術(shù)產(chǎn)品生物技術(shù)必須實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化才能取得應(yīng)有的社會和經(jīng)濟效益,根據(jù)國際發(fā)展生物技術(shù)的經(jīng)