高效毛細(xì)管電泳技術(shù)在多肽研究中的應(yīng)用

高效毛細(xì)管電泳技術(shù)在多肽研究中的應(yīng)用

隨著人類工作組序列分析和蛋白組學(xué)活動(dòng)的開(kāi)展，越來(lái)越多的人在生活活動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了重要的因素，如分子識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育等。這些物質(zhì)豐富化、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易用作一般物質(zhì)。如何利用微生物、互補(bǔ)基因工程和多孔合成技術(shù)，從不同來(lái)源（動(dòng)物、植物、微生物和人類）獲得更多的生物活性物質(zhì)，并成為一些引入研究的方向。1備份研究1.1氨基酸的組成我們常說(shuō)的蛋白質(zhì)是一種氨基酸聚合生物大分子,由肽鍵將多個(gè)單體氨基酸連接再經(jīng)適當(dāng)?shù)恼郫B形成的具有一定生物功能活性的復(fù)合物.依據(jù)其氨基酸組成數(shù)目可人為分為短肽(2~5個(gè)氨基酸)、多肽(6~16氨基酸)、蛋白質(zhì)(17個(gè)以上).1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1hpce技術(shù)分離領(lǐng)域的重要地位根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)材料(人體、動(dòng)物、植物和微生物)所采用的方法各不相同.常用的方法包括化學(xué)萃取法(如醇提、丙酮法)、水泡法、沉淀法、陰陽(yáng)離子交換吸附柱、Sephadex凝膠過(guò)濾柱、凝膠電泳、高效液相色譜(HPLC)、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)等.其中高效毛細(xì)管電泳(HPCE)是高效液相色譜(HPLC)之后,將電泳技術(shù)和色譜技術(shù)相結(jié)合的一種新的分析技術(shù).它具有分離效率高、速度快、上樣量少、靈敏度強(qiáng)等特點(diǎn).隨著新材料科學(xué)的發(fā)展,以毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳(MECC)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦(CIEF)、毛細(xì)管電色譜(CEC)、親和毛細(xì)管電泳(ACE)等為代表的HPCE分離模式大大拓展了此技術(shù)運(yùn)用范圍,再加之于紫外吸收、激光誘導(dǎo)熒光電化學(xué)以及質(zhì)譜等檢測(cè)手段相結(jié)合,更加確立了其在多肽研究領(lǐng)域的重要地位.例如林炳承等利用CZE在短時(shí)間內(nèi)成功將九個(gè)多肽類組分(舒緩激肽、血管緊張肽、促黑色素細(xì)胞激素、促甲狀腺激素釋放激素、促黃體生成激素釋放激素、亮內(nèi)啡肽、Bombesin、蛋白啡肽、催產(chǎn)素)的分離.又如Yashima等利用MECC在含有十二烷基磺酸鈉(SDS)或溴棕三甲銨(CTAB)的緩沖液中成功對(duì)不帶電組分中胃動(dòng)素Let13和Met13進(jìn)行了分離.但對(duì)于分離純化結(jié)構(gòu)極其相似并在pH范圍內(nèi)淌度幾乎完全相同的多肽混合物,CZE、HPLC均略遜色于MEKC法.后者可針對(duì)在脂溶性、電荷、大小、形態(tài)等方面稍有差異的任何被分析物.如董文玉等利用CZE、HPLC和MEKC分別對(duì)10種結(jié)構(gòu)相似多肽分離結(jié)果的比較,發(fā)現(xiàn)無(wú)論對(duì)于多肽混合物,還是單肽混合物,MEKC多優(yōu)于其余兩種.此外HPCE對(duì)重組人干擾素、酪蛋白糖肽等多肽的純化也存在重要作用.1.2.2質(zhì)譜分析方法從自然界中分離純化的多肽類物質(zhì),還需要進(jìn)一步對(duì)其生化特性、氨基酸組成、結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行分析研究.目前常用的方法有以下幾種:(①等電點(diǎn)測(cè)定(CIEF技術(shù))②分子量測(cè)定(SDS和SDS-CGE)③穩(wěn)定性研究(HPCE輔以基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜法)④氨基酸組成(Edman酶解、化學(xué)降解法或直接多肽特異酶解后經(jīng)HPCE和HPLC分離進(jìn)入氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行序列測(cè)定.)⑤結(jié)構(gòu)分析(質(zhì)譜技術(shù)如快原子轟擊質(zhì)譜、串聯(lián)質(zhì)譜、電噴霧質(zhì)譜、離子噴霧質(zhì)譜、等離子體解吸質(zhì)譜、激光解吸質(zhì)譜以及核磁共振、傅立葉紅轉(zhuǎn)換外光譜、圓二柱色譜等).1.2.3在定常設(shè)備上的應(yīng)用常用的多肽鑒定和檢測(cè)方法主要有HPLC、HPCE、質(zhì)譜、凝膠電泳等.此外吳玉章等采用二乙稀基砜醇、乙二胺和戊二醛活化硝酸纖維素膜,在膜上形成一“結(jié)合臂”.該臂含游離的醛基,可與短肽的游離氨基以肽鍵結(jié)合,從而建立了點(diǎn)免疫結(jié)合檢測(cè)法,并利用此方法成功區(qū)分只有一個(gè)殘基差異的一組七肽復(fù)合物.另一方面可以運(yùn)用基因工程技術(shù)將適合的報(bào)告基因連接到目的基因上,通過(guò)表達(dá)過(guò)程中的發(fā)光性或酶反應(yīng)等方式來(lái)對(duì)多肽進(jìn)行監(jiān)控.此外生物芯片技術(shù)的發(fā)展,為不同存在形式的多肽提供了新的檢測(cè)方法.例如將待測(cè)物質(zhì)分別與正常組織細(xì)胞和病變細(xì)胞作用后檢測(cè)兩者基因表達(dá)差異,再與原有信息比較,確定目的多肽物質(zhì)是否存在其中.又如利用特殊工藝多肽識(shí)別分子固定在生物芯片宋定性定量監(jiān)控水中多肽物質(zhì)的存在.2不同源代碼的多因素研究2.1抑制細(xì)胞dna合成人類自身體內(nèi)的生物活性肽類物質(zhì)因其毒性低,一直是多肽藥物研究的主要來(lái)源.例如王勇等利用鹽析法對(duì)人胎盤勻漿液進(jìn)行粗提取,經(jīng)DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換、洗脫,收集有活性組分再經(jīng)過(guò)分子量截留值為49.6KD的濾膜處理得到具有活性的人胎盤肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGT)多肽.經(jīng)作用于動(dòng)物模型活性測(cè)定表明此類多肽不但可以促進(jìn)正常大鼠肝細(xì)胞DNA合成,而且可以抑制癌細(xì)胞DNA的合成.如Reichell等利用SephadexG25和MG2000凝膠柱分離,再用DEAE纖維素和Dowex50離子交換柱結(jié)合RP-HPLC方法純化多肽產(chǎn)物,成功的從人工培養(yǎng)的黑素細(xì)胞與惡化黑素瘤細(xì)胞中分離提取到兩個(gè)多肽,經(jīng)氨基酸序列分析儀以及質(zhì)譜分析確定其結(jié)構(gòu)為pyroGlu-Phe-Gly-NH2(Ⅰ)和pyroGlu-Cys-Gly-NH2(Ⅱ),實(shí)驗(yàn)證明小肽Ⅰ具有抑制黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用.又如Hackler等利用分子排阻色譜法與RP-HPLC從人腦皮層組織中分離出一組小肽,并用放射性免疫親和(AIR)技術(shù)監(jiān)測(cè)確定其中的一個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)性小肽,再經(jīng)序列分析、電霧離子化質(zhì)譜分析以及與全合成肽結(jié)果進(jìn)行匹配確定了其序列結(jié)構(gòu)為:Tyr-Pro-Iys-Gly-NH2,其是一種具有類阿片樣作用的相似性小肽物質(zhì).如Tisso等利用多步HPLC從人乳蛋白中分離純化出一種三肽成分GLF(Gly-Leu-Phe-NH2),實(shí)驗(yàn)證明GLF具有刺激吞噬細(xì)胞增長(zhǎng),提高免疫力和抗球菌等細(xì)菌侵襲的功能.2.2抗菌肽和氨基酸的分離純化Predel等從蟑螂后腦復(fù)合物中利用三氯乙酸、五氯丁酸修飾的C18柱HPLC處理,再經(jīng)Edman降解及質(zhì)譜分析確定其結(jié)構(gòu)為:His-Thr-Ala-Gly-PheIle-Pro-Arg-Leu-NH2(Ⅰ)和Ser-Pro-Phe-Ala-Pro-ArgLeu-NH2(Ⅱ),此類化合物作為昆蟲(chóng)神經(jīng)激素,具有調(diào)節(jié)超級(jí)神經(jīng)肌肉、后腸肌系統(tǒng)收縮的功能.又如Fusetani利用HPLC從海綿TheonellaSP屬中分離到的三個(gè)線性四肽,其中NazumamideA結(jié)構(gòu)通過(guò)2DNMR和化學(xué)降解法確定為2,5-二羥基苯基-L-Arg-L-Pro-Ile-α-氨基丁酸,實(shí)驗(yàn)證明其具有凝血酶抑制活性.有人從鴕鳥(niǎo)胰腺中利用酸提、鹽分級(jí)、SpSephadexC50和QAE-SephadexA25柱以及RP-HPLC分離純化得到的69個(gè)氨基酸組成和單鏈多肽,實(shí)驗(yàn)證明其具有抑制鴕鳥(niǎo)及牛胰蛋白酶活性作用.Ebert-Sabatier等利用RP-HPLC、酶解、CZE等手段從蝎血淋巴組織中提取分離了三種不同的抗菌肽,通過(guò)Edman降解、電霧離子化質(zhì)譜分析確定氨基酸序列,并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其具有廣譜抗菌性,對(duì)革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌以及部分真菌都有殺傷作用.高貴波等利用磷酸緩沖液離心法從豬脾中提取脾肽,再經(jīng)RP-HPLC純化后通過(guò)多肽檢測(cè)(如微生物檢查、HbsAg檢測(cè)、蛋白質(zhì)氨基酸定性、核糖核酸檢查、總蛋白檢查、總氮量檢查等)以及臨床藥用證明其具有抑制惡性腫瘤,提高機(jī)體免疫力的功能.王國(guó)權(quán)用0.1MNaCl充分提取蠶中可溶性多肽和蛋白,經(jīng)(NH4)2SO4沉淀蛋白,將濾液用C18小柱吸附,再用水多次洗除去鹽和雜質(zhì)后,依次用含10%乙腈的洗脫液洗脫吸附的多肽,真空干燥,最后用HPLC和HPCE進(jìn)行分析.2.3在微膠囊中的應(yīng)用Chen等利用水醇提取法,結(jié)合離子交換、凝膠過(guò)濾和RP-HPLC從人參中分離到六種含α氨基酸的小肽,并經(jīng)氨基酸序列分析測(cè)定其結(jié)構(gòu)為氧化性的谷胱甘肽及類似物,實(shí)驗(yàn)證明其具有調(diào)節(jié)睡眠的作用.許家喜等將油菜花粉冷凍破壁水提物,經(jīng)SephadexG25柱凝膠過(guò)濾、Dowex50WX2離子交換柱梯度洗脫、脫鹽后得到十二肽RPPI,再經(jīng)Edman降解法測(cè)得序列為H-Ala-Ile-Gly-Leu-Val-Pro-SerGln-Thr-Asn-Gln-Asn-OH.然后運(yùn)用核磁共振對(duì)其在溶液中的構(gòu)象進(jìn)行研究,結(jié)果表明其在水溶液中主要以無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象存在,個(gè)別肽段存在γ轉(zhuǎn)角構(gòu)象.此外用固相法進(jìn)行其花粉小肽的人工合成,經(jīng)玫瑰花瓣和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)豬胸腺細(xì)胞的成熟有促進(jìn)作用,而對(duì)腫瘤有抑制作用.金聲等將罌粟花粉中多肽提取液分別經(jīng)陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂,得到含有兩性離子的氨基酸和多肽組分,進(jìn)行凝膠過(guò)濾得到只含肽的組分.再經(jīng)陽(yáng)離子交換柱,用揮發(fā)性緩沖液線性梯度洗脫、脫鹽及凝膠柱進(jìn)一步分離.最后RP-HPLC純化及電泳粗測(cè)分子量,氨基酸組成分析和N端丹磺酰化測(cè)定后分別得到含21、17、13和16個(gè)氨基酸殘基的四個(gè)多肽,再經(jīng)Edman降解結(jié)合質(zhì)譜分析確定其序列組成,并用傅立葉紅轉(zhuǎn)換外光譜(FI-IR)和圓二柱色譜(CD)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究.T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明其多肽具有一定的提高免疫功能的作用.胡一喬等利用硫酸銨沉淀法從鮮茵陳(ArtemisiacapillarisThumb)地上部粗提多肽物質(zhì),經(jīng)DEAE-Sephadex交換樹(shù)脂洗脫去色,收集物再經(jīng)分子量3000D的中空纖維超濾,截取分子量小于3000的小分子,所得濃縮液冷凍干燥成多肽粗品后,運(yùn)用HPLC純化并測(cè)定其分子量,后經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明所得多肽具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用的功能.沈蓓英等利用多肽組成中氨基酸自身生化特性運(yùn)用不同種蛋白酶,通過(guò)調(diào)節(jié)酶解的溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶和底物濃度以及pH值,實(shí)現(xiàn)對(duì)大豆蛋白抗氧性多肽的提取回收.Sinakos從蔥Alliumporum的根莖中用30%乙醇提取,并用HPLC純化得到1052KD小肽,Edman降解確定其氨基酸序列為:PheAsp-Ser-Thr-Arg-Pro.體外實(shí)驗(yàn)證明其在膠原與二磷酸腺苷作用下,具有抑制血小板凝聚作用.2.4氨基酸序列及氨基酸序列分析獲得多肽的方法除直接從組織細(xì)胞中提取外,還可以利用一些氨基酸特異性的蛋白水解酶水解某些蛋白質(zhì)而獲得,因此具有高效性、特異性酶類的獲得尤為重要.例如Hua等從芽孢桿菌體中通過(guò)SephadexG25色譜制備、提取、分離及HPLC純化得到蛋白酶S,經(jīng)氨基酸順序檢測(cè)確定其序列組成.實(shí)驗(yàn)證明其具有高效水解大豆蛋白作用,是一種高抗氧性短肽.又如有人從枯草桿菌BacillussubtillisATTCC6501中提取一種谷氨酸特異性肽鏈內(nèi)切酶,利用其特異切割作用,可獲得具有干擾素活性的多肽-BNP.3利用基因檢測(cè)和基因表達(dá)生物活性肽早期主要從天然動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)等生物體內(nèi)分離提取,但其具有周期長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn).20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的生物基因組合肽庫(kù)以及化學(xué)組合肽庫(kù)給多肽提取提供了便利.而我國(guó)目前對(duì)生物活性多肽的研究仍停留在“自然”狀態(tài),因此利用現(xiàn)在的分子生物學(xué)、基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲取目的基因、高表達(dá)載體以及多肽純化方法顯得尤為重要.我們可以利用已知或物種間高度同源性的基因序列作為引物,通過(guò)各種PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增得到目的基因,再選用適當(dāng)?shù)母弑磉_(dá)載體轉(zhuǎn)入易獲取的宿主中(如藻類、E.coli等)使其表達(dá)出目的多肽,從而擺脫長(zhǎng)期以來(lái)困擾人們的各種難點(diǎn).劉國(guó)安等用RT-PCR方法獲得前甲狀旁腺激素原(hPTH)基因,克隆入質(zhì)粒PBV220載體中(PBV220是一種帶有入噬菌體PRPL串聯(lián)啟動(dòng)子的溫度誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒),重新構(gòu)建成PGA555重組體并轉(zhuǎn)入E.coli中,在42℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá).經(jīng)過(guò)產(chǎn)物電泳測(cè)定、PCRDNA測(cè)序、表達(dá)產(chǎn)物HPLC-C18分析均與國(guó)外報(bào)道的一致.又如鄭偉等利用基因技術(shù)將人抗乙型肝炎表面抗原(Hbs-Ag)抗體Fab片段和干擾素IFN-αA分子水平上重新構(gòu)建原核表達(dá)載體PHSIFN-αA,并正常表達(dá),從而加強(qiáng)抗體導(dǎo)向效果并減少了單克隆抗體產(chǎn)生的副作用.4應(yīng)用4.1多肽藥物的結(jié)構(gòu)多肽作為藥物有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):分子量小,無(wú)免疫原性,比較安全;分子較小,易于合成,成本低;結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,功能較明確,特異性強(qiáng),副作用低;多肽藥物易于多途徑吸收;合成的多肽純度高,不存在熱原問(wèn)題.目前已有二十多種多肽藥物上市(如血脂康、地奧血脂康等),就其作用功能可分為多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽、導(dǎo)向多肽、細(xì)胞因子模擬肽、抗菌活性肽、降壓降脂多肽等.4.2蛋白質(zhì)的分離隨著多肽研究的深入,人們?cè)絹?lái)越重視食品的第三功能即調(diào)節(jié)人體生理的功能.譬如從不同蛋白質(zhì)來(lái)源分離得到具有如類嗎啡活性降壓、提高機(jī)體免疫力、抗氧化、低過(guò)敏及抗血栓等生理功能的小分子多肽物質(zhì),包括大豆蛋白及大豆多肽類、乳蛋白活性多肽類、抗性蛋白多肽類、膠原多肽類、水產(chǎn)多肽類等.4.3腦啡肽衍生化的大鼠血漿中腦髓液運(yùn)用多肽研究涉及的常規(guī)技術(shù),可以進(jìn)一步對(duì)多肽類物質(zhì)的動(dòng)力學(xué)以及體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程進(jìn)行研究,例如Chen等采用熒光試劑TRITC對(duì)大鼠血漿中腦啡肽進(jìn)行衍生化,經(jīng)H