低值魚蛋白制備多肽-鈣螯合物的研究

低值魚蛋白制備多肽-鈣螯合物的研究

近年來，人們普遍重視鈣營養(yǎng)不足的問題。老年人和兒童都應(yīng)該考慮鈣營養(yǎng)，而鈣是世界上的一個(gè)問題。我國的膳食組成以植物性食物為主,植酸鹽、纖維素、糖醛酸、藻酸鈉和草酸等含量較高,食物中鈣的吸收率很低。因此,除了尋求良好的鈣補(bǔ)充制劑外,提高現(xiàn)有膳食中鈣的吸收利用率亦是解決缺鈣問題的方法之一。而蛋白質(zhì)經(jīng)水解后得到的小肽,則能增加小腸對(duì)鈣的吸收及其在體內(nèi)的蓄積。這種由磷酸肽誘導(dǎo)的鈣代謝并不需要VD。雖然我們?cè)诿附獾鞍缀碗x子結(jié)合方面有了較大發(fā)展,但就水解度(DH)與離子結(jié)合的關(guān)系方面的研究在世界范圍內(nèi)幾乎為空白,且多數(shù)研究還僅局限于陸地的一些動(dòng)物蛋白。本實(shí)驗(yàn)提出以南海低值魚為原料采用木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶混合的復(fù)合酶控制水解方法制備DH小于20的水解物研究其對(duì)鈣離子結(jié)合活性,并對(duì)其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及活性進(jìn)行分析。1材料和方法1.1材料和機(jī)器1.1.1u/g,固體粉末南海新鮮小雜魚市售;木瓜蛋白酶(200萬U/g,固體粉末)、風(fēng)味酶(40萬U/g,固體粉末)廣西南寧龐博生物工程有限公司;亞油酸(linoleicacid)標(biāo)準(zhǔn)品、2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituricacidTBA)標(biāo)準(zhǔn)品、生育酚(α-tocopherol)標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司。1.1.2光學(xué)熱價(jià)測試?yán)状排芇HS-25型pH計(jì)、雷磁牌JB-1A型磁力攪拌器上海精科雷磁儀器廠;飛利浦?jǐn)嚢杵鱄R2838廣東中山五金器具制造廠;光學(xué)讀數(shù)分析天平(TG-328A)上海偉業(yè)儀器廠;離心機(jī)(TD5型臺(tái)式多管架低速離心機(jī))長沙英泰儀器有限公司;722S可見分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋(H.H.S)江蘇南通縣通海電器廠;FTS-17SC型經(jīng)傅立葉變換紅外光譜儀美國Bio-Red公司。1.1.3試劑無水氯化鈣(CaCl2)、濃硫酸(H2SO4)、高錳酸鉀(KMnO4)和鹽酸均為分析純。1.2方法和步驟1.2.1合成工藝1.2.2分析1.2.2.1游離氨基酸含量的測定按照GB/T5009.39-96甲醛法標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。1.2.2.2.游離態(tài)鈣含量的測定按照GB6226-86EDTA絡(luò)合滴定法標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。1.2.2.3.分辨率dh的測量式中,A為原料中總氨基氮數(shù);B為水解液中的氨基氮數(shù);C為原料游離的氨基氮數(shù)。1.2.2.4-4硫合率的測定螯合率測定公式:1.2.2.紅外分光光度法酶解液經(jīng)冷凍干燥后,得到肽粉。而螯合物產(chǎn)品經(jīng)酒精分級(jí)沉淀可得到4種螯合產(chǎn)物,將它們提純后,除去樣品中的游離水或結(jié)晶水,取固體樣品2mg放入瑪瑙研缽中,放入干燥的光譜純KBr200mg,混合研磨均勻(在紅外燈下進(jìn)行),使其粒度在2.5μm以下,裝入壓片模具,抽氣加壓,壓力約為60MPa,維持3~5min,卸掉壓力則可得一透明的KBr樣品片,利用島津IR-435紅外分光光度計(jì)進(jìn)行定性分析,得到光譜。1.2.2.tba-sds法硫代巴比妥酸法。具體方法:將0.2ml亞油酸的樣品加入30ml試管中,然后加入10ml99.5%乙醇和10ml50mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)。每一種樣品(50mg)加入到此混合溶液中,然后用蒸餾水定容至25ml。將其放入到培養(yǎng)箱中在40℃培養(yǎng)7d。TBA溶液根據(jù)Ohkawa等的方法配制。該溶液含有0.8ml水分、0.2ml8.1%SDS和1.5ml20%的醋酸,然后用10mol/L的NaOH和1.5ml0.8%TBA調(diào)pH至3.5。將50μl的氧化性的亞油酸溶液加入到混合液中,并在5℃培養(yǎng)1h,然后在100℃加熱1h。紅色素的濃度在波長535nm下測定其吸光度。結(jié)果被表示為對(duì)亞油酸的氧化抑制率,同α-生育酚的抗氧化性作對(duì)照比較。抑制率的計(jì)算公式:式中,A為加50μl去離子水、0.2ml亞油酸的吸光度;B為加50mg樣品、0.2ml亞油酸的吸光度;C為加50μlα-生育酚、0.2ml亞油酸的吸光度。1.2.2.活性肽螯合物活性檢測平板制備牛津杯雙層平板法。牛津杯雙層平板法檢測平板的制備:在無菌平皿中倒入10ml加熱融化的2%瓊脂,待其充分冷卻凝固后,放入已滅菌的牛津杯數(shù)個(gè),并按一定次序排放整齊。將分裝于大試管中的15ml固體檢測培養(yǎng)基融化后冷卻至50℃左右,加入108個(gè)/ml指示菌液1ml,迅速混合均勻,倒入平皿。冷卻后,用無菌鑷子取出牛津杯,作為活性肽螯合物活性檢測平板。用0.1ml吸管吸取100~200μl待測樣品,以無菌操作加入到檢測平板圓孔內(nèi),37℃培養(yǎng)15h,觀察并測定抑菌圈直徑(mm)。2結(jié)果與分析2.1脂肪對(duì)水解度的影響脂肪對(duì)復(fù)合酶水解蛋白的水解速率存在著一定影響,分別對(duì)脫脂(脂肪含量0.62%)和不脫脂(脂肪含量4.28%)兩種情況討論脂肪對(duì)水解度的影響。此反應(yīng)條件為木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶添加量為0.1%,溫度25℃,pH為6.5,結(jié)果如圖1、2。從圖1、2可以看出未脫去脂肪的魚肉蛋白在復(fù)合酶的條件下,水解度隨時(shí)間的變化增加較快,因此不脫去脂肪更有利于得到DH小于20的活性肽產(chǎn)物。2.2游泳條件優(yōu)化2.2.1反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)品得率的影響選取pH為7,時(shí)間為15min不變,分別在10、20、30、40℃下進(jìn)行螯合反應(yīng)的比較實(shí)驗(yàn),產(chǎn)品得率基本相同,非脫脂魚肉蛋白酶解螯合率為81%左右,脫脂魚肉蛋白酶解螯合率為79%左右,說明反應(yīng)溫度對(duì)絡(luò)合反應(yīng)影響不大,故以室溫為宜,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。2.2.2非脂魚蛋白酶解螯合率選取pH為7,溫度為室溫,分別在15、30、60min進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn),產(chǎn)品得率基本相同,非脫脂魚肉蛋白酶解螯合率為81%左右,脫脂魚肉蛋白酶解螯合率為79%左右,說明螯合反應(yīng)為快速反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間影響不大,與文獻(xiàn)報(bào)道一致,故以反應(yīng)15min為宜。2.2.3水解度對(duì)多肽利用率的影響不同水解度的活性肽產(chǎn)物,其平均肽鏈長度和配體摩爾數(shù)對(duì)存在著較大差異,平均肽鏈長度關(guān)系到鈣離子能否順利通過小腸粘膜,而配體摩爾比是影響金屬離子與多肽螯合反應(yīng)的一個(gè)重要因素,如果配位比太小,生成的螯合物不穩(wěn)定;反之,若配位比太高,便會(huì)造成多肽利用率下降。選取DH為5%、10%、15%和20%,溫度為室溫,時(shí)間為15min,pH為7研究水解度對(duì)螯合率的影響程度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。圖3表明,在同等條件下DH為5%時(shí),鈣離子螯合率最高,而當(dāng)DH為10%、15%、20%時(shí)脫脂的多肽螯合率要比未脫脂的螯合率高。2.2.4ph對(duì)螯合反應(yīng)的影響pH條件是影響多肽螯合微量元素形成螯合物的重要因素。在pH較低的酸性條件下,H+將與金屬離子競爭供電子基團(tuán),不利于多肽微量元素螯合物的生成;在pH較高的堿性條件下,羥基與供電子基團(tuán)爭奪金屬離子而形成氫氧化物沉淀。選取pH4~8范圍,在溫度為室溫,時(shí)間為15min,研究其對(duì)螯合反應(yīng)的影響程度,結(jié)果見圖4、5。由圖4、5可以看出,在一定pH范圍內(nèi),隨pH值升高螯合率提高,這是由于隨著pH值升高,-NH2和-COOH配位能力增強(qiáng)。當(dāng)pH>7時(shí)螯合率降低,說明溶液中開始有沉淀生成,不利于得到多肽鈣螯合物,故螯合物的pH值應(yīng)選擇7左右。2.3ca2+與-nh2的含量關(guān)系圖7中①②③分別代表魚肉酶解蛋白與鈣離子螯合的產(chǎn)物,其中①樣品為螯合反應(yīng)后不溶于水的物質(zhì);②樣品為螯合反應(yīng)后加50%無水乙醇分級(jí)沉淀得到的物質(zhì);③樣品為螯合反應(yīng)加80%無水乙醇分級(jí)沉淀得到的物質(zhì)。從圖6和7中對(duì)比可以看出,活性肽與其螯合物吸收峰相比,在強(qiáng)弱和位置上有明顯的變化,樣品①②③在3130~3030cm-1銨峰消失,而在1100cm-1左右出現(xiàn)了(PtNH2)吸收峰,證明Ca2+與-NH2有結(jié)合;羧基離子反對(duì)稱振動(dòng)(γascoo-)于1650cm-1附近,羧基離子的對(duì)稱振動(dòng)(γscoo-)于1400cm-1附近,這兩處均有較強(qiáng)吸收峰,證明Ca2+與-COO-有較強(qiáng)結(jié)合。反對(duì)稱振動(dòng)(γascoo-)是判斷-COOM鍵共價(jià)程度的量度,而反對(duì)稱振動(dòng)與對(duì)稱振動(dòng)的差值γ△υ(γascoo--γscoo-)是羧基離子與金屬離子配位方式的有力判據(jù)。樣品①③△υ均在250cm-1左右,樣品②△υ=236cm-1,推測鈣離子與羧基是以單齒共價(jià)鍵的方式結(jié)合。樣品①②③的鈣含量分別為16.58%、9.72%、7.68%可以看出螯合物隨著水溶和醇溶能力增加鈣含量減少,螯合能力減弱。2.4合成tba的原理采用TBA法,即硫代巴比妥酸法。亞油酸是一種多不飽和脂肪酸,是機(jī)體組織和細(xì)胞的組成成分,為人體最重要的必需脂肪酸。評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化能力大小有多種方法,其中硫代巴比妥酸(TBA)染料法為應(yīng)用較廣的方法之一。TBA法是基于不飽和脂肪酸通過自由基反應(yīng),形成過氧化自由基,而氧化生成環(huán)氧化物,后者分解生成丙二醛,丙二醛與TBA作用生成TBA染料,最大吸收波長為535nm。多肽螯合鈣的抗氧化作用如圖8所示。上圖中①②③分別代表魚肉酶解蛋白與鈣離子螯合經(jīng)無水乙醇分級(jí)沉淀的產(chǎn)物,由圖看出鈣螯合物都具有一定的抗氧化作用,其中樣品1即螯合反應(yīng)后未經(jīng)過無水乙醇分級(jí)沉淀得到的物質(zhì)抗氧化作用最強(qiáng),其抗氧化效果達(dá)到生育酚的94.43%。2.5草芽孢桿菌和細(xì)菌抗菌效果比較通過牛津杯雙層平板法,將活性肽及3種鈣螯合的樣品對(duì)大腸桿菌,枯草芽孢桿菌,金黃色葡萄球菌,沙門氏菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品3即螯合反應(yīng)加80%無水乙醇分級(jí)沉淀得到的物質(zhì)對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌效果,見圖9、10。牛津杯孔直徑為8mm,從圖9中可看出活性肽樣品并沒有抑菌圈出現(xiàn),從圖10中可看出樣品3有較好的抑菌效果,其抑菌圈直徑為16mm。而在對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),活性肽及其螯合物抑菌作用均不明顯,活性肽樣品無抑菌圈出現(xiàn),螯合物抑菌圈直徑分別為9mm和11mm。目前對(duì)螯合物抗菌的作用機(jī)理尚無定論,部分研究表明,螯合物的肽分子可能和細(xì)菌細(xì)胞膜受體蛋白結(jié)合,改變細(xì)胞質(zhì)膜通透性,造成膜結(jié)構(gòu)破壞,引起膜內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出,從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。3螯合物的抗氧化效果多肽螯合鈣離子最佳工藝條件為,DH5%,pH7,溫度為室溫,螯合15min,螯合率可達(dá)81.75%。螯合產(chǎn)品紅外光