全自動(dòng)熒光免疫分析儀工作原理

一、基本結(jié)構(gòu)（一）按照反應(yīng)裝置的結(jié)構(gòu)，自動(dòng)生化分析儀主要分為流動(dòng)式(FLOWSYSTEM)、分立式(DISCRETESYSTEM)兩大類。1．流動(dòng)式指測定項(xiàng)目相同的各待測樣品與試劑混合后的化學(xué)反應(yīng)在同一管道流動(dòng)的過程中完成。這是第一代自動(dòng)生化分析儀。2．分立式指各待測樣品與試劑混合后的化學(xué)反應(yīng)都是在各自的反應(yīng)杯中完成。其中有幾類分支。(1)典型分立式自動(dòng)生化分析儀。此型儀器應(yīng)用最廣。(2)離心式自動(dòng)生化分析儀，每個(gè)待測樣品都是在離心力的作用下，在各自的反應(yīng)槽內(nèi)與試劑混合，完成化學(xué)反應(yīng)并測定。由于混合，反應(yīng)和檢測幾乎同時(shí)完成，它的分析效率較高。3．袋式自動(dòng)生化分析儀是以試劑袋來代替反應(yīng)杯和比色杯，每個(gè)待測樣品在各自的試劑袋內(nèi)反應(yīng)并測定。4．固相試劑自定生化分析儀(亦稱干化學(xué)式自動(dòng)分析儀)是將試劑固相于膠片或?yàn)V紙片等載體上，每個(gè)待測樣品滴加在相應(yīng)試紙條上進(jìn)行反應(yīng)及測定。操作快捷、便于攜帶是它的優(yōu)點(diǎn)。(二)典型分立式自動(dòng)生化分析儀基本結(jié)構(gòu)1．樣品(SAMPLE)系統(tǒng)樣品包括校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣品。系統(tǒng)一般由樣品裝載、輸送和分配等裝置組成。樣品裝載和輸送裝置常見的類型有：(1)樣品盤(SAMPLEDISK)，即放置樣品的轉(zhuǎn)盤有單圈或內(nèi)外多圈，單獨(dú)安置或與試劑轉(zhuǎn)盤或反應(yīng)轉(zhuǎn)盤相套合，運(yùn)行中與樣品分配臂配合轉(zhuǎn)動(dòng)。有的采用更換式樣品盤，分工作和待命區(qū)，其中放置多個(gè)弧形樣品架(SECTOR)作轉(zhuǎn)載臺(tái)，儀器在測定中自動(dòng)放置更換，均對樣品盤上放置的樣品杯或試管的高度、直徑和深度有一定要求，有的需專用樣品杯，有的可直接用采血試管。樣品盤的裝載數(shù)，以及校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、常規(guī)樣品和急診樣品的裝載數(shù)，一般都是固定的。這些應(yīng)根據(jù)工作需要選擇。(2)傳動(dòng)帶式或軌道式進(jìn)樣即試管架(RACK)不連續(xù)，常為10個(gè)一架，靠步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)傳送帶，將試管架依次前移，再單架逐管橫移至固定位置，由樣品分配臂采樣。(3)鏈?zhǔn)竭M(jìn)樣試管固定排列在循環(huán)的傳動(dòng)鏈條上，水平移動(dòng)到采樣位置，有的儀器隨后可清洗試管。分配加樣裝置大都由注射器、步進(jìn)馬達(dá)或傳動(dòng)泵、加樣臂和樣品探針等組成，①注射器(SYRINEUNIT)。根據(jù)注射器直徑和活塞移動(dòng)距離的多少，定量吸取樣品或試劑。它的精度決定加樣的精度，一般可精確到1微升。注射器漏液時(shí)，首先考慮是否探針堵塞，其次是注射器活塞磨損等。有的加液系統(tǒng)采用容積型注射泵和數(shù)控脈沖步進(jìn)馬達(dá)，提高精度。②樣品探引(PROBE)與加樣臂相聯(lián)，直接吸取樣品。探針均設(shè)有液面感應(yīng)器，防止探針損傷和減少攜帶污染。有的設(shè)有阻塞檢測報(bào)警系統(tǒng)當(dāng)探針樣品中的血凝塊等物質(zhì)阻塞時(shí)．儀器會(huì)自動(dòng)報(bào)警沖洗探針，并跳過當(dāng)前樣品，對下一樣品加樣。有的還有智能化防撞裝置遇到阻礙探針立即停止運(yùn)動(dòng)并報(bào)警。即使如此，它仍是非正規(guī)操作時(shí)的易損件。為了保護(hù)探針，除預(yù)先需要根據(jù)樣品容器的高低、最低液面高度等進(jìn)行設(shè)置外、，樣品容器的規(guī)格、放置以及液面高度等設(shè)定條件不得隨意改變。在某些儀器上，采樣器和加液器組合在一起，加樣品和加試劑或稀釋液一個(gè)探針一次完成。③加樣臂。連接探引，在樣品杯(試劑瓶)和反應(yīng)杯之間運(yùn)動(dòng)，完成采樣和加樣(加試劑)。它的運(yùn)動(dòng)方式，與儀器工作效率及工作壽命有一定關(guān)系。④閥門用以決定液體流動(dòng)方向。⑤稀釋系統(tǒng)。對樣品進(jìn)行預(yù)稀釋、過后稀釋或加倍，對標(biāo)準(zhǔn)原液系列稀釋等。不同儀器的稀釋方式有所差異，要注意識(shí)別。試劑系統(tǒng)亦有稀釋功能：2．試劑(REAGENT)系統(tǒng)一般由試劑儲(chǔ)放和分配加液裝置組成。(1)試劑倉常與試劑轉(zhuǎn)盤結(jié)合在起。多數(shù)儀器將試劑倉設(shè)為冷藏室，以提高在線試劑的穩(wěn)定期。(2)分配加液裝置(DISPENSEUNIT)。與樣品系統(tǒng)的類似。，試劑探針常?？梢詫υ噭╊A(yù)加溫，雙試劑系統(tǒng)的試劑2(R2)探針起始量宜較下，以便配合不同R1/R2比例的試劑。(3)試劑瓶(BOTTLE)。有不同的形狀及大小規(guī)格。如COBASMIRAPLUS儀有4、10、15、35ML等規(guī)格，瓶底呈凹形，OLYMPUSAU600儀有30和60ML兩種；日立7060儀有20、50、100ML三種等規(guī)格。應(yīng)根據(jù)工作量和試劑規(guī)格．考慮試劑瓶殘留死體積和更換頻率，合理選用。獨(dú)特設(shè)計(jì)的卡式試劑盒，體積小，防蒸發(fā)，方便儲(chǔ)存。(4)配套試劑常有條形碼，儀器設(shè)有條形碼檢查系統(tǒng)，可對試劑的種類、批號、存量、有效期和校準(zhǔn)曲線等貨剌，進(jìn)行核對校驗(yàn)，如BECKMANCX7等。(5)試劑瓶蓋自動(dòng)開關(guān)系統(tǒng)，更有利于試劑保存。有的儀器可在運(yùn)行中添加，更換試劑，有的則須在暫停狀態(tài)進(jìn)行。3．條形碼(BARCODE)識(shí)讀系統(tǒng)一般由掃描系統(tǒng)、信號整形和譯碼器三部分組成。掃描系統(tǒng)以光源掃射黑條白空相間的條碼符號由于條和空對光的反射不同、不同寬窄的條符反射光持續(xù)時(shí)間不光片價(jià)格便宜，但易變潮霉變，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，半自動(dòng)生化分析儀多采用此種濾光片。光柵分光可分為全息反射式光柵和蝕刻式凹面光柵兩種。前者是在玻璃上覆蓋一層金屬膜后制成，有一定程度的相差易被腐蝕；后者是將所選波長固定地刻制在凹面玻璃上，耐磨損、抗腐蝕、無相差。全自動(dòng)生化分析儀多采用光柵分光。7．程序控制系統(tǒng)計(jì)算機(jī)是自動(dòng)生化分析儀的大腦，標(biāo)本、試劑的注加和識(shí)別，條碼的識(shí)別，恒溫控制，沖洗控制，結(jié)果打印，質(zhì)控的監(jiān)控，儀器各種故障的報(bào)警等都是由計(jì)算機(jī)控制完成。儀器一代勝過一代，自動(dòng)化程度越來越高，有的儀器甚至可以完成部分日常保養(yǎng)程序。自動(dòng)生化分析儀數(shù)據(jù)處理功能日趨完善，如：反應(yīng)進(jìn)程中吸光度，各種測定方法，各種校準(zhǔn)方法室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果的統(tǒng)計(jì)等，生化儀都可進(jìn)行處理。計(jì)算機(jī)還可以調(diào)看病人的數(shù)據(jù)、儀器的性能指標(biāo)、儀器的運(yùn)行狀態(tài)等。自動(dòng)生化儀中的質(zhì)控和病人結(jié)果還可通過儀器計(jì)算機(jī)與實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)(LIS)的對接進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)管理。程序控制器是系統(tǒng)的硬件部分。它主要包括：(1)微處理器和主機(jī)電腦。用于儀器各個(gè)單元和總體控制，應(yīng)具有程控操作、故障診斷、多種數(shù)據(jù)處理和儲(chǔ)存等強(qiáng)大功能。一般根據(jù)儀器功能的需要和電腦硬件市場的主流產(chǎn)品來配置。(2)顯示器(CRTMONITORUNIT)。通常用鍵盤、鼠標(biāo)、觸摸屏等方式進(jìn)行操作。(3)系統(tǒng)及配套軟件。多采用WINDOWS-NT或WINDOWS界面，具全圖形化設(shè)計(jì)，多菜單選擇，信息導(dǎo)引，故障報(bào)警，幫助提示，人機(jī)“對話”，方便直觀，不少儀器有即時(shí)反應(yīng)曲線顯示。(4)通過RS232C等數(shù)據(jù)接口與其他計(jì)算機(jī)、打印機(jī)等設(shè)備傳輸數(shù)據(jù)。具人工智能雙向通訊系統(tǒng)(HOSTQUERY)，儀器可直接自行向主電腦詢問病人／樣品基本資料及檢測項(xiàng)目。有的具遠(yuǎn)程通訊及監(jiān)控功能，可遙控遠(yuǎn)處測試及維修檢查，實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)工作。自動(dòng)生化分析儀均采用程序控制的自動(dòng)分析。分析程序一經(jīng)確定，工作時(shí)只要簡單地輸入測定項(xiàng)目或編碼，儀器即可按編制程序自動(dòng)完成測定、計(jì)算和報(bào)告。具體的控制程序因儀器而異，一般分為固定程序和自編程序兩種。固定程序?yàn)閮x器廠家預(yù)先設(shè)定，常與指定試劑配套；有的不能更改，有的也可由用戶修改。它與配套試劑一同使用時(shí)，既方便工作，質(zhì)量也比較可靠，但成本較高。自編程序靈活實(shí)用，便于開發(fā)新項(xiàng)目，強(qiáng)調(diào)程序的靈活性。比如，成批測定過程中應(yīng)可隨時(shí)插入急診標(biāo)本測定而不打亂原有程序；單個(gè)急診標(biāo)本測定操作簡捷、消耗少，可靈活預(yù)稀釋或重復(fù)測定。二、儀器一般工作流程生化分析儀的正確應(yīng)用，只是掌握了測定技術(shù)原理還不夠，還需要對具體儀器的工作流程及測定計(jì)算方法有足夠的了解。

(一)一般工作流程工作流程可以通過儀器的測定周期來考察。重點(diǎn)關(guān)注比色杯空白讀數(shù)點(diǎn)(CB)、加樣品點(diǎn)（S）、各試劑加液點(diǎn)(R1、R2、……)、試劑空白讀數(shù)點(diǎn)(RB)、各測定讀數(shù)點(diǎn)(P)、各點(diǎn)時(shí)間間隔及周期總時(shí)間等。每個(gè)儀器一般都在反應(yīng)轉(zhuǎn)盤的固定位置和反應(yīng)測定周期的固定時(shí)間設(shè)置樣品試劑和稀釋的加液位，以及測定讀數(shù)點(diǎn)。如HITACHI7170在P1到P34周期為10分鐘時(shí)，PO前加樣品，RL在PL前，R2在P5和P6間，R3在P16和P17間，R4在：P33和P34間。(二)數(shù)據(jù)處理計(jì)算方法儀器在各個(gè)吸光度讀數(shù)點(diǎn)讀取的吸光度數(shù)據(jù)，并不一定都納人濃度計(jì)算。儀器往往根據(jù)儀器定義和操作者設(shè)定的要求，對吸光度原始數(shù)據(jù)作計(jì)算處理，轉(zhuǎn)換成所謂反應(yīng)數(shù)據(jù)，再按系數(shù)或公式作濃度計(jì)算。舉例如下：1．HITACH7170的終點(diǎn)法測定點(diǎn)(A)吸光度計(jì)算為(AX+AX－1)／2。實(shí)際吸光度=吸光度數(shù)據(jù)×10000。2．0LYHPUSAU600試劑空白數(shù)據(jù)：P0點(diǎn)試劑空白(RB)=P0點(diǎn)吸光度一比色杯水空白(WB)；任一測定點(diǎn)試劑空白(RB)。該點(diǎn)吸光度一比色杯水空白(WB)。3．MONARCH1000兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)數(shù)據(jù)。(終點(diǎn)測定吸光度一終點(diǎn)空白吸光度)一(始點(diǎn)測定吸光度一始點(diǎn)空白吸光度)。4．AU600的終點(diǎn)法(帶試劑空白，END法)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=終點(diǎn)吸光度一P0點(diǎn)吸光度(試劑空白，RB)。終點(diǎn)法(不帶試劑空白，END)．法)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=終點(diǎn)吸光度-比色杯水空白(WB)。5．AU600的兩點(diǎn)法(自身空白)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=[加第二試劑后測定點(diǎn)讀數(shù)一P0點(diǎn)讀數(shù)]一[加第二試劑前測定點(diǎn)讀數(shù)一PO點(diǎn)讀數(shù)]。三、主要操作程序(一)儀器運(yùn)行前操作程序主要進(jìn)行儀器的基本設(shè)置：L．試驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置對試驗(yàn)名稱、編碼，試驗(yàn)組合(PROFILE)、試驗(yàn)輪次(ROUND)，必要時(shí)包括試驗(yàn)順序等設(shè)置。

2．各試驗(yàn)的參數(shù)設(shè)置包括試驗(yàn)間比值、結(jié)果核對等參數(shù)的設(shè)定。3．劑設(shè)置根據(jù)有關(guān)試驗(yàn)參數(shù)，設(shè)置各試驗(yàn)的試劑位、試劑瓶規(guī)格，必要時(shí)設(shè)定試劑批號、失效期等。4．校準(zhǔn)品設(shè)置對校準(zhǔn)品的位置、濃度和數(shù)量等進(jìn)行設(shè)置。5．質(zhì)控設(shè)置根據(jù)質(zhì)控要求。設(shè)置質(zhì)控物個(gè)數(shù)，質(zhì)控規(guī)則，質(zhì)控項(xiàng)目及相應(yīng)質(zhì)控參數(shù)等。6．樣品管設(shè)置包括樣品管類型，殘留液高度（死體積），識(shí)別方式等設(shè)置。7．其他設(shè)置對數(shù)據(jù)傳輸方式、結(jié)果報(bào)告格式、復(fù)查方式及復(fù)查標(biāo)準(zhǔn)等設(shè)置。(二)常規(guī)操作程序開機(jī)(預(yù)熱、保養(yǎng))-設(shè)置開始條件(日期時(shí)間索引、輪次、樣品起始號等)-根據(jù)需要，申請校準(zhǔn)、質(zhì)控和病人測定項(xiàng)目(包括架號、杯號或順序號。測定中可繼續(xù)申請)_裝載校準(zhǔn)品、質(zhì)控物和病人標(biāo)本-裝載試劑-核對儀器起始狀態(tài)（未應(yīng)用條碼系統(tǒng)，采用順序識(shí)別樣品時(shí)，尤其要核對測定起始編號是否與樣品架號和申請?zhí)栂喾?定標(biāo)和質(zhì)控測定-檢查定標(biāo)和質(zhì)控結(jié)果-病人標(biāo)本測定-測定過程監(jiān)控（試劑檢查，觀察分析結(jié)果，編輯校正）-數(shù)據(jù)傳遞（打印報(bào)告，向檢驗(yàn)管理系統(tǒng)傳輸，包括工作量統(tǒng)計(jì)、財(cái)務(wù)統(tǒng)計(jì)、病人情況追蹤、質(zhì)控分析等)。測定后保養(yǎng)。(三)測定結(jié)果檢查分析1．要了解和熟悉儀器的各種警示符號的含義與作用在正確設(shè)定參數(shù)的前提下，利用各種警示符能提高們發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的效率。2．要熟悉和靈活運(yùn)用儀器的相關(guān)操作屏(界面)如：用反應(yīng)過程監(jiān)測(REACTIONMONITOR)，觀察反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線；用校準(zhǔn)追蹤(CALIBRATIONTRACE)回顧分析校準(zhǔn)曲線；利用統(tǒng)計(jì)(STATISTICS)了解不同日期段病人測定均值及數(shù)據(jù)分析；運(yùn)用分析數(shù)據(jù)編輯(DATAEDIT)察看和校正測定數(shù)據(jù)。3．校準(zhǔn)的檢查要充分利用儀器設(shè)置的功能，監(jiān)測校準(zhǔn)曲線圖形、各校準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值(不能忽略試劑空白值及空白速率值)、計(jì)算K值等的波動(dòng)情況，以及與以往的比較。必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步檢查反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線。必須結(jié)合質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)來把握實(shí)驗(yàn)條件。4．病人結(jié)果的檢查除了目測觀察或用血清指數(shù)了解標(biāo)本性狀，注意和了解臨床資料及診斷外，學(xué)會(huì)分析反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線及數(shù)據(jù)是重要的基本功。四、基本測定方法

(一)終點(diǎn)法(ENDPOINTMETHOD)

根據(jù)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其吸光度大小，對物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法。對一般化學(xué)反應(yīng)來說，反應(yīng)完全(或正、逆反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡)、反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)。對抗原一抗體反應(yīng)來說，是抗原和抗體完全反應(yīng)、形成最大且穩(wěn)定的免疫復(fù)合物時(shí)為終點(diǎn)。在反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線上為與X軸平行線區(qū)段。在測定計(jì)算方式上，一般分為一點(diǎn)法和兩點(diǎn)法兩種。1．一點(diǎn)法(ONEPOINT)以試劑和樣品混合之前的空氣空白(GB)、水空白(WB)或試劑空白(RB)的吸光度值為測定計(jì)算基點(diǎn)，以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，得到反應(yīng)吸光度。通過與相同條件下校準(zhǔn)液反應(yīng)吸光度的比較，求得測定結(jié)果。常與一點(diǎn)校準(zhǔn)法配合使用，即采用一個(gè)校準(zhǔn)濃度，校準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)且成線性。也應(yīng)用多點(diǎn)校準(zhǔn)。2．兩點(diǎn)終點(diǎn)法(TWOPOINTEND)即終點(diǎn)一始點(diǎn)法以試劑和樣品混合之后的某一時(shí)間點(diǎn)作為始點(diǎn)，以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度讀數(shù)減去始點(diǎn)讀數(shù)。一定條件下可降低樣品對反應(yīng)或反應(yīng)本身的特異性于擾(主要指色度干擾)。常采用雙試劑，多以加R2前某一點(diǎn)作測定始點(diǎn)；某些情況下，也可以加R2后一點(diǎn)作測定始點(diǎn)。若使用單試劑，主反應(yīng)啟動(dòng)太快或儀器起始讀數(shù)點(diǎn)受限時(shí)難以運(yùn)用。固定時(shí)間法(FIXEDMETHOD)與兩點(diǎn)終點(diǎn)法的區(qū)別只是在：測定讀數(shù)的末點(diǎn)不在反應(yīng)平衡區(qū)段，而是根據(jù)方法學(xué)選擇。如血清肌酐(苦味酸法)測定。3．三點(diǎn)終點(diǎn)法即雙終點(diǎn)法，在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的終點(diǎn)法測定。比如同測游離脂肪酸和甘油三酯。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法。(二)連續(xù)監(jiān)測法(CONTINUOUSMONITORINGMETHOD)又稱速率法(RATEASSAY)。即連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)過程，根據(jù)所測定的產(chǎn)物生成或底物消耗的速度進(jìn)行定量分析的方法。在反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線上為反應(yīng)呈恒速區(qū)段(斜率保持不變)，常用于酶活性線性反應(yīng)期測定。1．連續(xù)監(jiān)測法即零級反應(yīng)速率法，亦稱斜率法。在較長的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)(至少90-120秒)，每隔一定時(shí)間(常為2~30秒)讀取一次吸光度值，至少讀取4點(diǎn)，得到3個(gè)△A；一般將連續(xù)多次讀數(shù)作最小二乘法處理，讀數(shù)間隔時(shí)間太短的作帶速率時(shí)間(TR)多點(diǎn)法處理，均取線性反應(yīng)部分的讀數(shù)，求出單位時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速率△A/MIN。此法必須以零級反應(yīng)為測定計(jì)算的基礎(chǔ)，因?yàn)橹挥性诹慵壏磻?yīng)下，單位時(shí)間內(nèi)的吸光度變化(反應(yīng)速率△A/MIN)才與酶活力呈正比。此法相對減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性。但是，半自動(dòng)生化分析儀采用單樣品連續(xù)監(jiān)測，相當(dāng)耗時(shí)。應(yīng)用連續(xù)監(jiān)測法，首先應(yīng)準(zhǔn)備線性范圍內(nèi)的高、中、低濃度的樣品，分別作反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線，了解不同濃度下反應(yīng)全過程，兼顧確定延遲時(shí)間和線性監(jiān)測期。2．兩點(diǎn)速率法即所謂擬一級速率法。在反應(yīng)中選取兩時(shí)問點(diǎn)T1、T2，讀取吸光度A1、A2，計(jì)算(A2-A1)，(T2-T1)=△A，△T。此方法與終點(diǎn)兩點(diǎn)法的區(qū)別主要有兩點(diǎn)：后一讀數(shù)點(diǎn)反應(yīng)未達(dá)終點(diǎn)，以速率計(jì)算結(jié)果。它與連續(xù)監(jiān)測法比較，缺點(diǎn)在于人為確定T1、T2，不定因素較多，不能保證反應(yīng)在T1-T2期間呈線性，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；應(yīng)在常規(guī)測定前，先做預(yù)試驗(yàn)來確定線性時(shí)間段。若在選擇的時(shí)間段內(nèi)反應(yīng)不成線性(如零級反應(yīng)期短，儀器無法設(shè)置或測定)，則只能改用終點(diǎn)法。優(yōu)點(diǎn)在于方法簡單；酶活力